五灵脂与人参配伍化学成分及体外药理活性变化研究硕士博士学位论文.docx

1、五灵脂与人参配伍化学成分及体外药理活性变化研究硕士博士学位论文硕士（博士）学位论文五灵脂与人参配伍化学成分及体外药理活性变化研究Study on compatibility of trogopterus dung and panax ginsengchanges in chemical and pharmacological activity in vitro 独 创 性 声 明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的

2、学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日关于论文使用授权的声明1、 本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人 （同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给

3、不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日导师签名： 签字日期： 年 月 日五灵脂与人参配伍化学成分及体外药理活性变化研究摘 要五灵脂与人参，是中药十九畏中临床应用较多的一对配伍，本论文对五灵脂与人参配伍进行了实验研究，可为临床合理配伍提供科学有效的重要依据。本论文包括化学实验研究和药理实验研究两大部分。在化学方面主要进行了以下研究：1.运用硅胶柱层析法分别从五灵脂的乙酸乙酯提取物中分离得到2个

4、化合物，分别为：-谷甾醇和原儿茶酸；从人参中分离提取得到3个化合物，分别为：人参皂苷Rd、Rc、Rb1。2.本论文对五灵脂脂肪酸及其他脂溶性成分进行了GC-MS分析，鉴定出42种化合物，其中脂肪酸15种，占脂溶性成分总含量的49.162%，非脂肪酸类成分27种，占脂溶性成分总含量的44.184%。本论文还采用水蒸气蒸馏法提取了五灵脂的挥发油。3.本论文通过中医药数据库中五灵脂与人参配伍应用的方剂考证，选取了4个应用较广泛的配伍比例，分别为：五灵脂与人参配伍5:1、3:1、1:1、1:3。并分别用紫外分光光度法、高效液相法对不同比例配伍后样品中的总黄酮、原儿茶酸、总皂苷和9种单体皂苷的含量变化进

5、行了考察，结果表明：对人参皂苷的含量测定表明：二者并用后使人参皂苷类活性成分含量普遍降低，总皂苷及不同配伍比例的人参皂苷类活性成分降低程度有区别；但配伍比例变化与含量变化并不成线性关系，且经配伍后的样品中人参皂苷Rb3含量明显升高。对总黄酮的含量测定表明：配伍后溶液中的总黄酮含量变化显著，但并不成线性相关，且五灵脂与人参配伍为3:1时，溶液中总黄酮含量达到一个接近于单一五灵脂溶液中的总黄酮含量值。对原儿茶酸的含量测定表明：配伍后溶液中的原儿茶酸含量变化显著，且五灵脂与人参配伍为5:1，3:1，1:1时，溶液中的原儿茶酸含量都明显高于单味五灵脂中的原儿茶酸含量。在药理实验方面主要进行了以下研究：

6、1.抗氧化方面，本论文采用DPPH法，对五灵脂不同溶剂提取物及其挥发油、五灵脂与人参不同比例配伍后的醇提物进行体外抗氧化活性研究，结果表明：各组分均对DPPH自由基有清除能力。五灵脂的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物对DPPH有较强的清除能力；五灵脂的清除DPPH自由基能力比人参更好，合用后，随着五灵脂量的减少，添加人参量的增加，其清除DPPH的能力逐渐减弱。2.抑菌方面，本文选择了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对五灵脂不同溶剂提取物及其挥发油、五灵脂与人参不同比例配伍后的醇提物的体外抑菌活性进行研究，结果表明：各组分对大肠杆菌ATCC8099和金黄色葡萄球菌ATCC6538均表现出不同的抑制其生长的活

7、性。五灵脂不同溶剂提取物中，氯仿提取物和乙酸乙酯提取物对两种菌的抑菌效果都尤为显著，其中在氯仿提取物浓度为25 mg/ml时，对两种菌的抑制率都最高，达到60.06%和57.81%，与空白对照组比较有极显著差异（P0.01）；五灵脂的挥发油对大肠杆菌ATCC8099和金黄色葡萄球菌ATCC6538的生长均具有抑制作用，但抑菌效果并不明显；五灵脂与人参的醇提物对两种菌的生长也都具有抑制作用，但五灵脂与人参二者醇提物比较，五灵脂醇提物的抑菌作用明显优于人参醇提物抑菌作用，随着配伍比例中五灵脂量的减少，配伍后的醇提物对两种菌生长的抑制作用也逐渐降低，以5:1配伍的醇提物浓度为25 mg/ml时，抑制

8、率最高，达到73.55%和60.58%，与空白对照组比较有极显著差异（P0.01），且以5:1比例配伍的醇提物，其抑菌效果最为显著甚至强于单一五灵脂的抑菌效果。关键词：五灵脂，人参，化学成分，配伍实验，抗氧化活性，抑菌活性Study on compatibility of trogopterus dung and panax ginsengchanges in chemical and pharmacological activity in vitroAbstract Trogopterus dung and Panax ginseng, is one pair of nineteen her

9、bs of mutual antagonism. Was prescription in common use in clinical practice. Experiments on compatibility of the tow medicines were practiced and summarized in this thesis.Chemical and pharmacology studies are tow main parts of the thesis. In chemical works, tow compounds were isolated from EtOAc f

10、raction of trogopterus dung abstract they were Beta sitosterol and proto-catechuic acid. Three compounds were isolated from Ginseng abstract, they were saponin Rd, Rc and Rb1. Fat-soluble composition in trogopterus dung was analysed by GC-MS method, 42 compounds were identified and 15 of them were f

11、at-acid, with a content of 49.162 percent. Volatile oil in trogopterus dung was extracted by steam distillation. Four commonly used compatibility proportion of the tow medicines were compared, 5:1, 3:1, 1:1 and 1:3. Variation of content of total flavonoid and saponin were determined by UV, while con

12、tent of protocatechuric acid and other nine saponins were determine by HPLC. Results showed under polypharmacy condition, saponin in ginseng declined except Rb3, and there was no linear relationship between proportion and the content. Content of protocatechuric acid varied as change of compatibility

13、 proportion, under condition of 5:1, 3:1 and 1:1, protocatechuric acid in extract had a higher content than in single trogopterus dung.In pharmacology study, antioxidation activity was tested by DPPH method. Activity of extracts from trogopterus dung by different solvent, volatile oil, and different

14、 compatibility proportion were compared, EtOAc and n-BuOH fraction of trogopterus dung had stronger activity in eliminating DPPH radical, and the activity decreased as gingseng goes to a higher proportion in compatibility. Bacteriostatic study was carried on colibacillus and staphylococcus aureus, a

15、ll above groups performed inhibition, chloroform and ethyl acetate extract of trogopterus dung showed outstanding inhibition ratio, under 25 mg/ml condition, the ratio came to 60.06% and 57.81%. Volatile oil of trogopterus dung also showed inhibition activity, but was not significant. Both gingseng

16、and trogopterus dung ethanol extract were able to inhibit colibacillus and staphylococcus aureus, while trogopterus dung group performed stronger. Proportion 5:1 came to the highest inhibition ratio at concentration of 25 mg/ml, the ratio was 73.55% and 60.58%, which was significant difference to th

17、e blank, that was even higher than single trogopterus dung.Our study manifested the following results: Compatibility of the tow medicines, affected content of some saponin in ginseng, and enhanced activity components in trogopterus dung. As proportion of panax ginseng went higher, activity of antiox

18、idation and bacteriostasis declined, but some of them performed stronger. This indicates that, compatibility of trogopterus dung and panax ginseng is feasible in clinical use for treatment of trogopterus dung-treating diseases.Key word：Trogopterus dung，Panax ginseng，Chemical studies ，compatibility，a

19、ntioxidation activity，Bacteriostatic study目 录第一章 前言 81.1 五灵脂与人参配伍研究概况 81.2 五灵脂研究概况 121.3 人参研究概况 15第二章 五灵脂、人参化学成分研究 182.1 五灵脂的化学成分研究 182.2 人参的化学成分研究 27第三章 五灵脂与人参配伍化学成分变化研究 303.1 五灵脂与人参配伍中总黄酮的含量变化研究 303.2 五灵脂与人参配伍的原儿茶酸含量变化研究 343.3 人参与五灵脂配伍中总皂苷的含量变化研究 413.4 人参与五灵脂配伍中9个人参皂苷单体的含量变化研究 44第四章 DPPH法体外抗氧化活性研究

20、 524.1 清除DPPH自由基的原理 534.2 实验材料、仪器及试剂 534.4 结果与讨论 55第五章 体外抑菌活性研究 595.1 实验材料、仪器及试剂 595.2 实验方法 605.3 实验结果 625.4 结果与讨论 71第六章 结论 73参考文献 76致谢 79作者简介 80 插图清单图1-1 复齿鼯鼠及五灵脂 13图2-1 五灵脂提取流程图 20图2-2 五灵脂脂溶性成分总离子流色谱图 22图2-3 人参总皂苷提取流程图 28图3-1 芦丁标准曲线示意图 32图3-2 总黄酮含量变化趋势示意图 33图3-3 原儿茶酸标准曲线示意图 36图3-4 原儿茶酸标准品HPLC 36图3

21、-5 单味五灵脂HPLC 38图3-6 五灵脂与人参配伍5:1HPLC 38图3-7 五灵脂与人参配伍3:1HPLC 39图3-8 五灵脂与人参配伍1:1HPLC 39图3-9 五灵脂与人参配伍1:3HPLC 39图3-10 原儿茶酸含量变化趋势示意图 40图3-11 人参皂苷Re含量变化趋势示意图 42图3-12 总皂苷含量变化趋势图示意图 44图3-13 人参皂苷标准品HPLC检测结果 45图3-14 单味人参HPLC 46图3-15 五灵脂与人参配伍1:3HPLC 46图3-16 五灵脂与人参配伍1:1HPLC 46图3-17 五灵脂与人参配伍3:1HPLC 46图3-18 五灵脂与人参

22、配伍5:1HPLC 46图3-19 人参皂苷Rb1、Rb2、Rf、Rg1、Rg2含量变化趋势 49图3-20 人参皂苷Rb3含量变化趋势 49图3-21 人参皂苷Rc、Rd含量变化趋势 50图3-22 人参皂苷Re含量变化趋势 50图4-1五灵脂各层提取物清除DPPH活性 56图4-2五灵脂与人参配伍的醇提物清除DPPH活性 57图4-3五灵脂挥发油清除DPPH活性 58表格清单表2-1 五灵脂脂肪酸成分组分及相对含量 23表2-2 五灵脂非脂肪酸成分组分及相对含量 24表3-1 样品称量 32表3-2 五灵脂、五灵脂和人参配伍的总黄酮含量 34表3-3 样品称量 35表3-4 原儿茶酸标准曲

23、线数据 36表3-5 对照品的精密度（n=3） 37表3-6 重现性实验结果 37表3-7 稳定性实验结果 37表3-8 加样回收率测定结果 38表3-9 含量测定结果 40表3-10 人参、五灵脂和人参配伍的总皂苷含量 43表3-11 样品称量 45表3-12 人参皂苷检测的色谱条件 45表3-13 含量测定结果 48表4-1五灵脂各层提取物清除DPPH活性 55表4-2五灵脂与人参配伍的醇提物清除DPPH活性 56表4-3五灵脂挥发油清除DPPH活性 57表5-1不同阳性药的抑菌圈直径(mm) 62表5-2五灵脂石油醚提取物的抑菌作用（n=3） 63表5-3 五灵脂氯仿提取物的抑菌作用（n

24、=3） 63表5-4 五灵脂乙酸乙酯提取物的抑菌作用（n=3） 64表5-5 五灵脂正丁醇提取物的抑菌作用（n=3） 65表5-6 五灵脂挥发油的抑菌作用（n=3） 66表5-7 五灵脂醇提物的抑菌作用（n=3） 66表5-8 五灵脂与人参（5:1）配伍后醇提物的抑菌作用（n=3） 67表5-9 五灵脂与人参（3:1）配伍后醇提物的抑菌作用（n=3） 68表5-10 五灵脂与人参（1:1）配伍后醇提物的抑菌作用（n=3） 69表5-11 五灵脂与人参（1:3）配伍后醇提物的抑菌作用（n=3） 69表5-12 人参醇提物的抑菌作用（n=3） 70第一章 前言1.1 五灵脂与人参配伍研究概况1.1

25、.1 五灵脂与人参配伍的文献研究中药十九畏是中药药性理论的重要组成部分，其是否为临床配伍禁忌，从古至今都颇有争议。而本文研究的五灵脂与人参正是中药十九畏中临床应用较多的一对配伍，对其进行实验研究，可为临床合理配伍提供科学有效的重要依据。参考李德全1的五灵脂与人参配伍的方剂统计分析结果，得知五灵脂与人参配伍共用的古今方剂共47首。其中以五灵脂功效、主治为主的方剂有34首，以人参功效、主治为主的方剂有8首，以二者功效并重的有5首。1.1.1.1 以五灵脂功效、主治为主的方剂有：1.化癥回生片：五灵脂（醋炙）14g，人参42g。处方来源：中国药典（2000年版）。2.七珍散：五灵脂5钱，人参5钱。处

26、方来源：玉案卷五。3.人参川芎汤：五灵脂1分，人参1分。处方来源：医碥卷六。4.马兜铃散：五灵脂1两，人参1两。处方来源：圣惠卷四十六。5.乌蛇丸：五灵脂（炒）1两，人参1两。处方来源：圣济总录卷十一。6.五灵脂汤：五灵脂1两，人参半两。处方来源：圣济总录卷六十五。7.五灵脂汤：五灵脂5分，人参8分，。处方来源：女科玉尺卷四。8.五灵脂散：五灵脂杏核大，人参1钱。处方来源：鸡峰卷二十。9.全生锭：五灵脂（水飞）2钱半，人参2钱半。处方来源：诚书卷八。10.化癥回生丹：五灵脂2两，人参6两。处方来源：温病条辨卷一。11.太一神应丹：五灵脂1分，人参2分半。处方来源：秘传外科方。12.牛黄搜风丸：

27、五灵脂1两，人参3两。处方来源：疡医大全卷二十八。13.世秘资生丹：五灵脂（醋浸，瓦焙）5钱，人参5钱。处方来源：宁坤秘籍卷上。14.仙传一块气丸：五灵脂1钱1字，人参1钱1字。处方来源：医学入门卷七。15.白虎丸：五灵脂3两，人参3两。处方来源：普济方卷九十三。16.产宝丸：五灵脂（醋炒）5钱，人参（炒）5钱。处方来源：奇方类编卷下。17.产后丸：五灵脂5钱，人参3钱。处方来源：全国中药成药处方集（南京方）。18.安胃散：五灵脂（以醋和面裹，烧令香熟去面）杏核大，人参1分。处方来源：普济方卷三十六引指南方。19.妇科回生丹：五灵脂（醋炒）5钱，人参（去芦）3钱。处方来源：全国中药成药处方集（

28、天津方）。20.朱砂丸：五灵脂半两，人参1分。处方来源：圣惠卷八十二。21.返元汤：五灵脂钱半，人参5分。处方来源：简明医彀卷七。22.定坤丹：五灵脂（醋炒）5钱，人参（去芦）5两，。处方来源：北京市中药成方选集。23.狐肝丸：五灵脂1两，人参1两半。处方来源：圣济总录卷六。24.绎皮丸：五灵脂2两，人参2两。处方来源：朱氏集验方卷十。25.转治汤：五灵脂2钱，人参5钱。处方来源：辨证录卷三。26.保和锭子：五灵脂5分，人参2钱半。处方来源：万氏家抄方卷五引钱氏方。27.神仙秘宝丹：五灵脂（炒）8钱，人参（去芦）半两。处方来源：杨氏家藏方卷一。28.胡黄连丸：五灵脂半两，人参半两。处方来源：圣

29、济总录卷一七七。29.消癖丸：五灵脂1钱，人参3分。处方来源：普济方卷三九一。30.琥珀人参丸：五灵脂1两，人参1两。处方来源：张氏医通卷十三。31.紫金锭子：五灵脂5分，人参2钱半。处方来源：古今医鉴卷十三。32.散血消肿汤：五灵脂5分，人参7分。处方来源医学入门卷七。33.集圣丸：五灵脂（炒）2钱，人参3钱。处方来源：幼幼集成卷三。1.1.1.2 以人参功效、主治为主的方剂有：1.乌附苁蓉丸：人参半两，五灵脂半两。处方来源：普济方卷二四三。2.长生聚宝丹：人参（去芦）2两，五灵脂1两。处方来源：医方类聚卷一五三引经验秘方。3.回生丹：人参9g，五灵脂15g。处方来源：金鉴卷四十八。4.补阳

30、固代长生延寿丹：人参7钱，五灵脂5钱。处方来源：中国医学大辞典引彭祖方。5.豆蔻藿香汤：人参1两，五灵脂1两半。处方来源：医方类聚卷八十九引施圆端效方。6.固本暖脐膏药：人参5钱，五灵脂5钱。处方来源：活人方卷二。7.彭祖固阳固蒂长生延寿丹：人参7钱，五灵脂5钱。处方来源：医学入门卷一。8.蒸脐秘妙方：人参7钱，五灵脂5钱。处方来源：遵生八笺卷十八。1.1.1.3 以二者功效并重的方剂有：1.益气活血汤：人参10g，五灵脂 10g。处方来源：福建中医药1993,24（5）：132.八珍加味汤：人参3钱，五灵脂3钱。处方来源：医中一得。3.华山五子丹：人参2两，五灵脂2两。处方来源：医方类聚卷八

31、十九引施圆端效方。4.灵砂丹：人参（去芦）半两，五灵脂1分。处方来源：幼幼新书卷二十三引医方妙选。5.参脂四物汤：人参2钱，五灵脂（微焙，研末，酒飞，去砂）2钱。处方来源：医林纂要卷八。1.1.1.4 讨论：人参从古至今一直作为重要药物，在各方面应用的都比较多，尤其在抗衰老方面应用较多。但是从上边内容分析可知，在五灵脂和人参配伍应用的方剂中大多数是以五灵脂的主治功效为主的，多用于胃痛瘀血症和妇科瘀血症，二者配伍后虽然也有用于抗衰老的治疗，但数量较少，只有2-3首，这一点与人参大量在抗衰老方剂中应用这一现象很不相称，是否提示：五灵脂与人参配伍后，五灵脂使人参在抗衰老方面的作用丧失了？人参又是否使五灵脂的在某些方面的作用增强了？国内在对五灵脂与人参配伍后的很多方面都进行了实验研究，多数是对人参部分活性成分变化进行研究，但从文献分析来看，五灵脂与人参配伍，多数是以五灵脂功效、主治为主，但目前对五灵脂与人参配伍后五灵脂活性成分含量变化方面尚缺乏研究来证实，因此，本论文以此作为深入研究的方向之一。1.1.2 五灵脂与人参配伍化学实验研究进展近年来，有很多学者从