NKG2D介导NK细胞对鼻咽癌细胞杀伤作用的体外研究.docx

1、NKG2D介导NK细胞对鼻咽癌细胞杀伤作用的体外研究NKG2D介导NK细胞对鼻咽癌细胞杀伤作用的体外研究【摘要】 目的 探讨鼻咽癌CNE2细胞表面HLA I类分子表型和NKG2D配体的表达情况，进一步了解其对同种异体NK细胞杀伤活性的影响。方法 流式细胞仪检测NKG2D的配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3在K562、CNE2细胞的表达情况。PCR SSP法分析CNE2细胞HLA A、B、Cw分型和NK细胞KIR分型。LDH释放法测定5例健康者NK细胞在不同效靶比时对K562、CNE2细胞的杀伤活性，效靶比201时观察抗NKG2D配体的单抗对NK细胞杀伤K562、CNE2

2、细胞活性的影响。结果 CNE2细胞表达MICA、MICB、ULBP2，不表达ULBP1、ULBP3。K562细胞表面表达MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3。5例健康者NK细胞抑制性KIR与CNE2细胞表面的HLA I类分子之间存在错配。效靶比51、101、201、301时NK细胞对K562、CNE2细胞的杀伤活性分别为()%、()%；()%、()%；()%、()%；()%、()%,在各效靶比时NK细胞对K562细胞的杀伤活性较CNE2细胞明显增强(=)；在效靶比201时anti MICA、anti MICB、anti ULBP1、anti ULBP2、anti ULBP3可

3、明显抑制NK细胞对K562细胞的杀伤活性，与阻断前相比有显着性差异(=)；anti MICA、anti MICB、anti ULBP2可明显抑制NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性，与阻断前相比有显着性差异()，但anti ULBP1、anti ULBP3不能阻断NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性。结论 NKG2D配体影响NK细胞对靶细胞的杀伤活性，提高NKG2D配体的表达有可能提高NK细胞的抗肿瘤活性。【关键词】 自然杀伤细胞；NKG2D；杀伤细胞免疫球蛋白样受体Abstract：Objective To analyze HLA class I molecules and the expressi

4、on of NKG2D ligands in human nasopharyngeal carcinoma cell line (CNE2) and their effects on cytotoxicity of natural killer (NK) cells. Methods The expression of NKG2D ligands on the surface of CNE2 and K562 cells were analyzed by flow cytometry. The HLA class I molecules in CNE2 cells and killer cel

5、l immunoglobulin like receptors(KIR) expressed by NK cells (isolated from 5 healthy persons) were analyzed by PCR SSP. Cytotoxicities of NK cells against CNE2 and K562 cells were detected by LDH releasing assay at different effect to target cell ratios (ET). In blocking experiments, different anti N

6、KG2D ligands monoclonal antibodies (mAbs) were added to the target cells at 201 ET ratio. Results It was found that MICA, MICB, ULBP2 were expressed by CNE2, ULBP1, ULBP3 were not detectable on CNE2; K562 expressed all the NKG2D ligands. There were mismatches between inhibitory KIRs expressed by NK

7、cells and HLA class I molecules expressed by the CNE2 cells. NK cells displayed highly in vitro cytotoxicity against K562 and CNE2 cells with anlysis of ()%, ()%; ()%, ()%; ()%, ()%; ()%, ()% respectively at 51，101, 201, 301 ET ratios(P=). Blocking experiments confirmed that killing of K562 by NK ce

8、lls was efficiently inhibited by anti MICA mAb, anti MICB mAb, anti ULBP1 mAb, anti ULBP2 mAb and anti ULBP3 mAb. anti MICA mAb. Anti MICBmAb, anti ULBP2 mAb could partially inhibit the cytotoxicity of NK cells against CNE2 cells, whereas anti ULBP1 mAb and anti ULBP3 mAb could not inhibit the cytot

9、oxicity of NK cells. Conclusion Expression of NKG2D ligands is correlated with the cytotoxicity of NK cells. NK mediated cytolytic activity may be boosted by engineering cells expressing high levels of activating NKG2D ligands.Key words：Natural killer cell; NKG2D; Killer cell immunoglobulin like rec

10、eptor0 引言 NK细胞对靶细胞的杀伤活性与其细胞表面的受体和靶细胞表面的配体密切相关。NK细胞表面的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Inhibitory killer cell immunoglobulin like receptor,iKIR)与靶细胞表面特定的HLA I类分子结合可以明显抑制NK细胞的活性，靶细胞缺乏iKIR特定的配体将激发NK细胞对其杀伤活性 1。NKG2D为NK细胞的活化性受体，表达于所有的NK细胞表面，是介导NK细胞识别和溶解肿瘤细胞的主要活化性受体。NKG2D的配体为MHC I类链相关基因产物(MICA、MICB)及ULBPS(人巨细胞病毒UL16蛋白的结合蛋

11、白ULBP1、ULBP2、ULBP3)，NKG2D的配体在多种肿瘤细胞表达，其在鼻咽癌细胞的表达尚未见报道。本研究主要探讨鼻咽癌CNE2细胞株HLA I类分子表型和NKG2D配体的表达情况，进一步了解其对同种异体NK细胞杀伤活性的影响。 1 材料和方法材料 NK细胞分离缓冲液及CD56 MicroBeads，FITC标记的山羊抗小鼠IgG1，RPMI1640(Gibco公司)，淋巴细胞分离液，rhIL 2(上海华新公司)，NK细胞杀伤活性检测试剂盒(CytoTox96 Non Radioactive Cytotoxocity Assay，Promega公司)，KIR PCR SSP分型试剂盒(

12、Dynal公司)，PCR SSP A、B、Cw特异性引物试剂盒，流式细胞仪(Coulter公司)，AMO 1(anti MICA，IgG1)，BMO 1(anti MICB，IgG1)，M295(anti ULBP1，IgG1)，M310/100% 统计学处理方法 应用软件进行数据处理，采用独立样本t检验。 2 结果NK细胞的纯度 流式细胞仪检测CD3CD16+CD56+细胞的纯度达90%以上。 K562、CNE2细胞表面NKG2D的配体表达 本研究结果显示CNE2细胞表面MICA、MICB、ULBP1的表达率分别为()%、()%、()%，不表达ULBP1、ULBP3；K562细胞表面MICA

13、、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3的表达率分别为()%、()%、()%、()%、()%，见表1。表1 NKG2D的配体在K562、CNE2细胞表面表达的阳性细胞百分数(略) CNE2细胞表面HLA A、B、Cw基因分型结果 CNE2细胞表面HLA A、B、Cw表型为A2,24；B18,35；Cw4,7。 KIR基因分型 5例健康人均表达KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2。 NK细胞杀伤活性 本研究结果显示NK细胞对K562、CNE2细胞的杀伤活性在效靶比51时分别为()%、()%；效靶比101时分别为()%、()%；效靶比201时分别为()%、()%；效

14、靶比301时分别为()%、()%，在各效靶比时NK细胞对K562细胞的杀伤活性较CNE2细胞明显增强；效靶比201时AMO 1、BMO 1、M295、M310、M551分别对K562细胞表面相应位点进行封闭,NK细胞对K562细胞的杀伤活性分别为()%、()%、()%、()%、()%和阻断前()%相比有显着性差异,见图1;效靶比201时AMO 1、BMO 1、M310分别对CNE2细胞表面相应位点进行封闭,NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分别为()%、()%、()%与阻断前()%相比有显着性差异；M295、M551对CNE2细胞表面相应位点进行封闭,NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分别为()%

15、、()%，与阻断前相比无明显变化,见图2。 3 讨论 NK细胞是机体内重要的淋巴细胞亚群, 在肿瘤免疫中NK细胞构成了第一道杀伤防线。NK细胞表面的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(iKIR）与靶细胞表面特定的HLA I类分子结合可以明显抑制NK细胞的活性，靶细胞缺乏iKIR特定的配体(KIR 配体错配)将激发NK细胞对靶细胞的杀伤活性 1。不同的iKIR分子识别并结合不同的HLA I类分子。KIR2DL1识别HLA Cw2、Cw4、Cw5、Cw6；KIR2DL2/2DL3识别HLA Cw1、Cw3、Cw7、Cw8 ；KIR3DL1识别HLA B w4；KIR3DL2识别HLA A3、A11；其

16、余的KIR配体尚未明确 。KIR2DL1、KIR2DL2/2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2是目前已知的影响NK细胞同种异体反应性的主要抑制性受体 1。 NKG2D是1991年Houchins等在NK细胞中发现的，NKG2D除表达在所有NK细胞上外，在绝大多数T 细胞、CD8 +T细胞上也有表达 。人NKG2D的配体分为两大类：第一类包括MICA、MICB，属于非经典的HLA I类基因，集中表达于胃肠道上皮细胞表面，在大多数上皮性肿瘤细胞如肺癌、乳腺癌、肾癌及卵巢癌、结肠癌肿瘤组织中也有表达。第二类人NKG2D 配体由ULBP1、ULBP2、ULBP3 组成，均带有MHC样1、2 结构域

17、，并通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞表面，其表达较广泛，可以表达于多种细胞、组织、肿瘤，是NKG2D发挥杀伤活性的主要配体。 研究表明，由于肿瘤细胞的MHC I类分子丢失或变异， 使得特异性MHC限制性的细胞毒T细胞不能发挥作用，在这种情况下，识别非MHC I类分子的NKG2D在介导NK细胞识别和溶解肿瘤细胞的免疫反应中发挥关键作用 。NKG2D通过与靶细胞表面诱导产生的相应配体结合，然后结合转接蛋白向NK细胞传递活化信号，使NK细胞获得攻击靶细胞的能力，另外还可能为CD8 +T细胞提供必要的协同刺激信号。在很大程度上NKG2D的活化决定了机体的抗肿瘤细胞免疫水平。 本研究表明CNE2细

18、胞表达MICA、MICB、ULBP2，不表达ULBP1、ULBP3；CNE2细胞表面HLA A、B、Cw表型为A2，24、B18，35、Cw4，7，不表达BW4、A3、A11分子，因此5例健康个体体内表达KIR3DL1、KIR3DL2的NK细胞与CNE2细胞之间存在KIR 配体错配现象。有研究表明94%个体表达KIR3DL1，KIR3DL2为NK细胞的框架基因，任意个体的NK细胞均表达KIR3DL2 ，因此任意个体的NK细胞均与CNE2细胞之间存在着KIR 配体错配现象，结合NKG2D配体的检测结果表明任意个体的NK细胞都存在杀伤CNE2细胞的分子基础。本研究显示NK细胞对CNE2细胞有较高的

19、杀伤活性，anti MICA、anti MICB、anti ULBP2均可不同程度地抑制NK细胞对CNE2的杀伤活性，说明NKG2D在NK细胞杀伤CNE2细胞中起主导作用。 K562细胞不表达HLA I类分子，因此任意个体的NK细胞都与之存在KIR 配体错配现象，本研究结果表明K562细胞表达MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3。NK细胞对K562细胞具有较高的杀伤活性，anti MICA、anti MICB、anti ULBP1、anti ULBP2、anti ULBP3均可不同程度地抑制NK细胞对K562细胞的杀伤活性，说明NK细胞杀伤K562细胞通过NKG2D发挥作用。

20、 研究表明 7 9，肿瘤细胞表面NKG2D配体在体内存在膜型和可溶性两种形式，可溶性NKG2D配体与NKG2D的结合可诱导T、NK细胞表面NKG2D的内化和降解，下调NKG2D表达，进而严重损害肿瘤抗原特异性T细胞效应，同时削弱NK细胞的活性，促进肿瘤免疫逃逸。鼻咽癌患者体内是否存在高浓度的可溶性NKG2D配体，能否作为患者的临床预后指标，值得我们进行进一步深入研究。 【参考文献】 1Hsu KC, Keever Taylor CA, Wilton A, et al. Improved outcome in HLA identical sibling hematopoietic stem ce

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