NKG2D介导NK细胞对鼻咽癌细胞杀伤作用的体外研究.docx

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NKG2D介导NK细胞对鼻咽癌细胞杀伤作用的体外研究

NKG2D介导NK细胞对鼻咽癌细胞杀伤作用的体外研究

【摘要】目的探讨鼻咽癌CNE2细胞表面HLAI类分子表型和NKG2D配体的表达情况，进一步了解其对同种异体NK细胞杀伤活性的影响。

方法流式细胞仪检测NKG2D的配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3在K562、CNE2细胞的表达情况。

PCRSSP法分析CNE2细胞HLAA、B、Cw分型和NK细胞KIR分型。

LDH释放法测定5例健康者NK细胞在不同效靶比时对K562、CNE2细胞的杀伤活性，效靶比20∶1时观察抗NKG2D配体的单抗对NK细胞杀伤K562、CNE2细胞活性的影响。

结果CNE2细胞表达MICA、MICB、ULBP2，不表达ULBP1、ULBP3。

K562细胞表面表达MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3。

5例健康者NK细胞抑制性KIR与CNE2细胞表面的HLAI类分子之间存在错配。

效靶比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1时NK细胞对K562、CNE2细胞的杀伤活性分别为（±）%、（±）%；（±）%、（±）%；（±）%、（±）%；（±）%、（±）%,在各效靶比时NK细胞对K562细胞的杀伤活性较CNE2细胞明显增强（Ｐ=）；在效靶比20∶1时antiMICA、antiMICB、antiULBP1、antiULBP2、antiULBP3可明显抑制NK细胞对K562细胞的杀伤活性，与阻断前相比有显着性差异（Ｐ=）；antiMICA、antiMICB、antiULBP2可明显抑制NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性，与阻断前相比有显着性差异（Ｐ），但antiULBP1、antiULBP3不能阻断NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性。

结论NKG2D配体影响NK细胞对靶细胞的杀伤活性，提高NKG2D配体的表达有可能提高NK细胞的抗肿瘤活性。

【关键词】自然杀伤细胞；NKG2D；杀伤细胞免疫球蛋白样受体

　　Abstract：

ObjectiveToanalyzeHLAclassImoleculesandtheexpressionofNKG2Dligandsinhumannasopharyngealcarcinomacellline（CNE2）andtheireffectsoncytotoxicityofnaturalkiller（NK）cells.MethodsTheexpressionofNKG2DligandsonthesurfaceofCNE2andK562cellswereanalyzedbyflowcytometry.TheHLAclassImoleculesinCNE2cellsandkillercellimmunoglobulinlikereceptors（KIR）expressedbyNKcells（isolatedfrom5healthypersons）wereanalyzedbyPCRSSP.CytotoxicitiesofNKcellsagainstCNE2andK562cellsweredetectedbyLDHreleasingassayatdifferenteffecttotargetcellratios（E∶T）.Inblockingexperiments,differentantiNKG2Dligandsmonoclonalantibodies（mAbs）wereaddedtothetargetcellsat20∶1E∶Tratio.ResultsItwasfoundthatMICA,MICB,ULBP2wereexpressedbyCNE2,ULBP1,ULBP3werenotdetectableonCNE2;K562expressedalltheNKG2Dligands.ThereweremismatchesbetweeninhibitoryKIRsexpressedbyNKcellsandHLAclassImoleculesexpressedbytheCNE2cells.NKcellsdisplayedhighlyinvitrocytotoxicityagainstK562andCNE2cellswithanlysisof（±）%,（±）%;（±）%,（±）%;（±）%,（±）%;（±）%,（±）%respectivelyat5∶1，10∶1,20∶1,30∶1E∶Tratios（P=）.BlockingexperimentsconfirmedthatkillingofK562byNKcellswasefficientlyinhibitedbyantiMICAmAb,antiMICBmAb,antiULBP1mAb,antiULBP2mAbandantiULBP3mAb.antiMICAmAb.AntiMICBmAb,antiULBP2mAbcouldpartiallyinhibitthecytotoxicityofNKcellsagainstCNE2cells,whereasantiULBP1mAbandantiULBP3mAbcouldnotinhibitthecytotoxicityofNKcells.ConclusionExpressionofNKG2DligandsiscorrelatedwiththecytotoxicityofNKcells.NKmediatedcytolyticactivitymaybeboostedbyengineeringcellsexpressinghighlevelsofactivatingNKG2Dligands.

　　Keywords：

Naturalkillercell;NKG2D;Killercellimmunoglobulinlikereceptor

　　0引言

NK细胞对靶细胞的杀伤活性与其细胞表面的受体和靶细胞表面的配体密切相关。

NK细胞表面的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体（Inhibitorykillercellimmunoglobulinlikereceptor,iKIR）与靶细胞表面特定的HLAI类分子结合可以明显抑制NK细胞的活性，靶细胞缺乏iKIR特定的配体将激发NK细胞对其杀伤活性[1]。

NKG2D为NK细胞的活化性受体，表达于所有的NK细胞表面，是介导NK细胞识别和溶解肿瘤细胞的主要活化性受体。

NKG2D的配体为MHCI类链相关基因产物（MICA、MICB）及ULBPS（人巨细胞病毒UL16蛋白的结合蛋白ULBP1、ULBP2、ULBP3），NKG2D的配体在多种肿瘤细胞表达，其在鼻咽癌细胞的表达尚未见报道。

本研究主要探讨鼻咽癌CNE2细胞株HLAI类分子表型和NKG2D配体的表达情况，进一步了解其对同种异体NK细胞杀伤活性的影响。

　　1材料和方法

　　材料

NK细胞分离缓冲液及CD56MicroBeads，FITC标记的山羊抗小鼠IgG1，RPMI1640（Gibco公司），淋巴细胞分离液，rhIL2（上海华新公司），NK细胞杀伤活性检测试剂盒（CytoTox96NonRadioactiveCytotoxocityAssay，Promega公司），KIRPCRSSP分型试剂盒（Dynal公司），PCRSSPA、B、Cw特异性引物试剂盒，流式细胞仪（Coulter公司），AMO1（antiMICA，IgG1），BMO1（antiMICB，IgG1），M295（antiULBP1，IgG1），M310/×100%

　　统计学处理方法

应用软件进行数据处理，采用独立样本t检验。

　　2结果

　　NK细胞的纯度

流式细胞仪检测CD3－CD16+CD56+细胞的纯度达90%以上。

　　K562、CNE2细胞表面NKG2D的配体表达

本研究结果显示CNE2细胞表面MICA、MICB、ULBP1的表达率分别为（±）%、（±）%、（±）%，不表达ULBP1、ULBP3；K562细胞表面MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3的表达率分别为（±）%、（±）%、（±）%、（±）%、（±）%，见表1。

表1NKG2D的配体在K562、CNE2细胞表面表达的阳性细胞百分数（略）

　　CNE2细胞表面HLAA、B、Cw基因分型结果

CNE2细胞表面HLAA、B、Cw表型为A2,24；B18,35；Cw4,7。

　　KIR基因分型

5例健康人均表达KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2。

　　NK细胞杀伤活性

本研究结果显示NK细胞对K562、CNE2细胞的杀伤活性在效靶比5∶1时分别为（±）%、（±）%；效靶比10∶1时分别为（±）%、（±）%；效靶比20∶1时分别为（±）%、（±）%；效靶比30∶1时分别为（±）%、（±）%，在各效靶比时NK细胞对K562细胞的杀伤活性较CNE2细胞明显增强；效靶比20∶1时AMO1、BMO1、M295、M310、M551分别对K562细胞表面相应位点进行封闭,NK细胞对K562细胞的杀伤活性分别为（±）%、（±）%、（±）%、（±）%、（±）%和阻断前（±）%相比有显着性差异,见图1;效靶比20∶1时AMO1、BMO1、M310分别对CNE2细胞表面相应位点进行封闭,NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分别为（±）%、（±）%、（±）%与阻断前（±）%相比有显着性差异；M295、M551对CNE2细胞表面相应位点进行封闭,NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分别为（±）%、（±）%，与阻断前相比无明显变化,见图2。

　　3讨论

NK细胞是机体内重要的淋巴细胞亚群,在肿瘤免疫中NK细胞构成了第一道杀伤防线。

NK细胞表面的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体（iKIR）与靶细胞表面特定的HLAI类分子结合可以明显抑制NK细胞的活性，靶细胞缺乏iKIR特定的配体（KIR配体错配）将激发NK细胞对靶细胞的杀伤活性[1]。

不同的iKIR分子识别并结合不同的HLAI类分子。

KIR2DL1识别HLACw2、Cw4、Cw5、Cw6；KIR2DL2/2DL3识别HLACw1、Cw3、Cw7、Cw8；KIR3DL1识别HLABw4；KIR3DL2识别HLAA3、A11；其余的KIR配体尚未明确。

KIR2DL1、KIR2DL2/2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2是目前已知的影响NK细胞同种异体反应性的主要抑制性受体[1]。

NKG2D是1991年Houchins等在NK细胞中发现的，NKG2D除表达在所有NK细胞上外，在绝大多数γδT细胞、CD8+αβT细胞上也有表达。

人NKG2D的配体分为两大类：

第一类包括MICA、MICB，属于非经典的HLAI类基因，集中表达于胃肠道上皮细胞表面，在大多数上皮性肿瘤细胞如肺癌、乳腺癌、肾癌及卵巢癌、结肠癌肿瘤组织中也有表达。

第二类人NKG2D配体由ULBP1、ULBP2、ULBP3组成，均带有MHC样α1、α2结构域，并通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定在细胞表面，其表达较广泛，可以表达于多种细胞、组织、肿瘤，是NKG2D发挥杀伤活性的主要配体。

研究表明，由于肿瘤细胞的MHCI类分子丢失或变异，使得特异性MHC限制性的细胞毒T细胞不能发挥作用，在这种情况下，识别非MHCI类分子的NKG2D在介导NK细胞识别和溶解肿瘤细胞的免疫反应中发挥关键作用。

NKG2D通过与靶细胞表面诱导产生的相应配体结合，然后结合转接蛋白向NK细胞传递活化信号，使NK细胞获得攻击靶细胞的能力，另外还可能为CD8+T细胞提供必要的协同刺激信号。

在很大程度上NKG2D的活化决定了机体的抗肿瘤细胞免疫水平。

本研究表明CNE2细胞表达MICA、MICB、ULBP2，不表达ULBP1、ULBP3；CNE2细胞表面HLAA、B、Cw表型为A2，24、B18，35、Cw4，7，不表达BW4、A3、A11分子，因此5例健康个体体内表达KIR3DL1、KIR3DL2的NK细胞与CNE2细胞之间存在KIR配体错配现象。

有研究表明94%个体表达KIR3DL1，KIR3DL2为NK细胞的框架基因，任意个体的NK细胞均表达KIR3DL2，因此任意个体的NK细胞均与CNE2细胞之间存在着KIR配体错配现象，结合NKG2D配体的检测结果表明任意个体的NK细胞都存在杀伤CNE2细胞的分子基础。

本研究显示NK细胞对CNE2细胞有较高的杀伤活性，antiMICA、antiMICB、antiULBP2均可不同程度地抑制NK细胞对CNE2的杀伤活性，说明NKG2D在NK细胞杀伤CNE2细胞中起主导作用。

K562细胞不表达HLAI类分子，因此任意个体的NK细胞都与之存在KIR配体错配现象，本研究结果表明K562细胞表达MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3。

NK细胞对K562细胞具有较高的杀伤活性，antiMICA、antiMICB、antiULBP1、antiULBP2、antiULBP3均可不同程度地抑制NK细胞对K562细胞的杀伤活性，说明NK细胞杀伤K562细胞通过NKG2D发挥作用。

研究表明[79]，肿瘤细胞表面NKG2D配体在体内存在膜型和可溶性两种形式，可溶性NKG2D配体与NKG2D的结合可诱导T、NK细胞表面NKG2D的内化和降解，下调NKG2D表达，进而严重损害肿瘤抗原特异性T细胞效应，同时削弱NK细胞的活性，促进肿瘤免疫逃逸。

鼻咽癌患者体内是否存在高浓度的可溶性NKG2D配体，能否作为患者的临床预后指标，值得我们进行进一步深入研究。

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