包裹RuBpy二氧化硅荧光纳米探针的制备及其用于肝癌细胞的识别.docx

1、包裹RuBpy二氧化硅荧光纳米探针的制备及其用于肝癌细胞的识别包裹RuBpy二氧化硅荧光纳米探针的制备及其用于肝 癌细胞的识别1引言随着纳米技术的迅猛发展， 各种各样的纳米材料已被广泛应 用于生物分析、物质分离、疾病诊断和治疗等生物医学领域。荧 光纳米材料， 如半导体荧光量子点、 碳点和包裹染料的二氧化硅 纳米颗粒等， 通过表面偶联生物功能分子 （如抗体或适配体） 后， 形成具有靶向功能的荧光纳米探针， 从而应用于高灵敏的生物分 析17。生物分析最常用的标记材料是有机荧光分子， 但具有 易光漂白、生物相容性较差等缺点，极大地限制了其应用。为了 克服有机荧光染料的上述缺点， 开发具有光稳定性的荧

2、光标记材 料，成为人们关注的目标。 二氧化硅复合荧光纳米颗粒不仅具有 良好的生物相容性、表面易修饰、抗光漂白性、低成本、易分离 和良好亲水性等优点 8， 9 ，而且能够使核酸酶远离固定在其表 面的DNA分子，从而保护DNA免受核酸酶的降解1012。由于 抗体能与抗原特异性结合， 目前已有研究将抗体分子偶联到二氧 化硅纳米颗粒制备具有靶向性的荧光纳米探针， 并将其用于细菌 检测、癌细胞识别和抗原检测等方面 1317。癌胚抗原（CEA是一种分子量为180200 kDa的多糖蛋 白复合物， 属于肿瘤细胞表面的结构抗原。 CEA 作为一种最常见 的肿瘤标志物， 被广泛用作各种消化系肿瘤的诊断及监测指标

3、18 。免疫标记成像法是一种常见的原位检测肿瘤标志物的方 法，它通过研究细胞膜或细胞内部特定生物化学参数的变化与差 异来实现对肿瘤细胞的识别与检测，操作简单、结果直观，在癌 症的诊断和转移研究领域具有重要意义。本实验以肝癌细胞膜表面 CEA为靶标，将包裹钉联吡啶（RuBpy）的二氧化硅复合荧光纳米颗粒表面生物功能化，制备 成可进行生物标记的纳米探针，分别用于肝癌细胞 LM 9、Huh 7的识别与成像。与染料分子相比，带正电荷的RuBpy分子通过静 电作用能够被稳定地束缚在带有负电荷的二氧化硅矩阵里， 二氧 化硅壳层的保护使自由氧不能接近荧光染料分子。 同时， 大量的 染料分子被包裹在二氧化硅纳

4、米颗粒核内， 从而起到信号放大的 作用1921。2实验部分2.1仪器与试剂二氧化硅纳米颗粒形貌及粒径采用日本 JEM100CXII 型透射 电镜进行测定；官能团表征采用美国 Nicolet 5700 型红外光谱 仪测量；细胞成像采用 Nikon ECLIPSE TE2000 U 荧光倒置显微 镜。曲拉通（ Triton X 100）、环己烷、正己醇、氨水、正硅酸四乙酯（TEOS、羧基乙基硅烷三醇钠盐 （CEOS、羟基（聚 乙二醇） 丙基 三乙氧基硅烷（ HPEOPES、 1 乙基 （3 二甲 基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC、N羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo NHS、亲和素（Avidin ）

5、、2 （N吗啡啉乙磺酸（MES、 钉联吡啶 （Rubpy）,均购于Sigma公司；人肝癌LM 9细胞株 由武汉大学中南医院提供；人肝癌 Huh 7 细胞株购于中国典型 物培养中心；其它试剂均为分析纯， 实验用水均采用三次蒸馏水。2.2表面官能团修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒合成包裹染料的二氧化硅纳米颗粒合成采用油包水（ W/O的反相微乳法 22 。首先取 1.77 mL Triton X 100 、 7.5 mL 环己烷、 1.6 mL正己醇和400卩L水，于室温下磁力搅拌 10 min后形成 微乳体系；在此体系中加入 80卩L浓度为0.1mol/L钉联吡啶 溶液，搅拌5 min，加入100卩L

6、TEOS搅拌30 min后再加入 60卩L氨水在室温下搅拌用于引发形成核壳结构。 24 h后，向体系中加入50卩L TEOS和50卩L CEOS在室温下进一步搅拌 12 h 可以得到羧基修饰的二氧化硅纳米颗粒（ RSiNPs COOH ； 而PEG修饰的二氧化硅纳米颗粒（RSiNPs PEG则加入100 a L TEOS和 100 a L HPEOPES当反应完成时，用丙酮破乳，最后分 别用乙醇和水离心洗涤 3次，将得到的纳米颗粒经真空冷冻干燥 后备用。2.3亲和素修饰的二氧化硅荧光纳米探针的制备2.3.1探针 A 的制备 将 1 mg EDC、 2.5 mg Sulfo NHS 和 1 mg

7、 羧基修饰的纳米颗粒一起加入到 1 mL 0.1 mol/L MES 缓冲 液中， 并在室温下活化反应 15 min 。整个溶液经离心洗涤后重 新分散在1 mLPBS缓冲液（pH 7.4 ）中，立即加入50 a L 1 g/L 亲和素后， 在室温下置于摇床反应 2 h，随后向溶液中加入100卩L含有2%牛血清蛋白的PBS缓冲液封闭1 h。待反应完成后， 经离心洗涤后亲和素修饰的纳米颗粒被重新分散在 PBS缓冲液（pH 7.4 ）中，并在4 C下保存备用。2.3.2探针 B 的制备将1 mg PEG修饰的纳米颗粒分散到 1 mL 2 mol/L Na2CO3 缓冲液中，充分混匀后，立即加入 1

8、mL 溴化氰的乙腈溶液（ 0.8 g/mL），室温下搅拌15 min，经活化的纳米颗粒用冰水和 PBS 缓冲液（pH 7.4 ）各洗2次后，分散到1mL PBS缓冲液，立即向 溶液中加入50卩L 1 mg/mL亲和素，置于4 C反应24 h ,待 反应完成后加入100卩L含有2%牛血清蛋白的PBS缓冲液，在 4 C过夜。经过反复离心洗涤后亲和素修饰的纳米颗粒被重新分 散在PBS缓冲液（pH7.4 ）中，并在4 C下保存备用。 2.4肝癌细胞的培养与识别2.4.1肝癌细胞的培养 将肝癌细胞LM 9、Huh 7用DME培 养基（含 10%小牛血清、 100 mg/L 链霉素和 100 mg/L 青

9、霉素） 吹散，于5% CO2 37 C培养箱中培养。待细胞铺满培养瓶底 部90%寸，用1 mL 1%胰蛋白酶消化液处理细胞 13 min，待细 胞脱离培养瓶壁，加入 9 mL DME培养基，待细胞吹匀后将其平 均分装在两个培养瓶中。取一定体积的细胞接种于 96 孔培养板 中继续培养，培养至细胞密度达到 50%80%寸用于实验。培养与传代寸所用器皿及试剂均进行过高压灭菌或过滤除菌。2.4.2肝癌细胞 LM 9的识别分别取100卩L探针A和探针B到已固定好LM 9细胞的培 养板中，并在每孔补加100卩L PBS缓冲液（pH 7.4 ）置于37 C 下孵育2 h，孵育完成后，再用 PBS缓冲液洗涤3

10、次，以除去 没有反应的探针。对照组与实验组操作的区别在于前者不加兔抗 CEA抗 体。2.4.3肝癌细胞 Huh 7 的识别取100卩L探针B到已固定好Huh 7细胞的培养板中，并在 每孔补加100卩L PBS缓冲液（pH 7.4 ）置于37 C下孵育2 h, 孵育完成后，再用PBS缓冲液洗涤3次，以除去没有反应的探 针。对照组与实验组操作的区别在于前者不加兔抗 CEA抗体。3结果与讨论3.1二氧化硅荧光纳米颗粒大小形貌表征采用透射电镜对合成的羧基和 PEG修饰的二氧化硅的进行 了表征，从图1可见，羧基和PEG修饰纳米颗粒都有很均一的尺 寸，粒径约为60 nm。此外，通过高分辨电镜可以明显地观察

11、到 包裹荧光染料二氧化硅纳米颗粒的核壳结构。3.2荧光光谱和红外表征实验表明，荧光染料RuBpy溶液的荧光发射光谱的最大发射 波长为610 nm,本研究制备的两种包裹 RuBpy的荧光纳米颗粒 RSiNPs COOI和RSiNPs PEG均发射明亮的红色荧光，其最大发 射波长分别为609和610 nm因此，二氧化硅基本上不影响 RuBpy 的荧光发射光谱。通过红外光谱对二氧化硅球表面的官能团进行了证实， 结果 如图 2所示。 特征峰归属如下： 3400 cmSymbolm 1左右的为OH的反对称伸缩振动和对称伸缩振动， 1100 cmSymbolm 1 附近的吸收峰为亚甲基的伸缩振动，证明二氧

12、化 硅复合纳米颗粒表面已分别成功修饰上了羧基和 PEG。3.3肝癌细胞识别和成像采用间接免疫荧光法对肝癌细胞表面的 CEA进行标记，并通过抗原 抗体、生物素 亲和素之间的特异性结合来实现对靶标的 免疫荧光标记成像，从而实现对肝癌细胞的识别。分别使用RSiNPs COOH RSiNPs PEG乍为信号指示探针对肝癌细胞 LM 9 表面的CEA进行标记。为了考察纳米探针是通过抗原抗体特异性靶向模式与肝癌 细胞结合， 还是通过非特异性吸附于肝癌细胞表面， 设置了对照 组实验：以PBS代替兔抗CEA抗体IgG。探针A和探针B对LM9 中CEA的标记结果如图3所示。在探针A对细胞的识别实验组中，在荧光图

13、像中可观察到部 分肝癌细胞 LM 9 表面发出了红色荧光，而在明场和荧光的叠加 图像中，部分细胞并未发出红色的荧光， 这可能是因为探针 A与 细胞之间存在空间位阻，仅有部分细胞被标记。而在探针B的识 别实验组中，荧光显微镜下可观察到绝大部分肝癌细胞 LM 9 表面发出了强烈的红色荧光， 在明场和荧光场的叠加图中绝大部分 的细胞均发出了红色荧光，说明了肝癌细胞 LM 9 表面结合了大 量的探针B。在相应的对照组中，肝癌细胞几乎没有荧光信号， 说明探针B与肝癌细胞之间无明显的非特异性吸附。 这表明探针B是以抗体 抗原结合模式结合到肝癌细胞表面的，同时也说明 在avidin与PRSiNPs之间的PE

14、G分子，极大地提高了 Avidin分 子的自由度和活性 23 ， 24。上述方法具有普适性， 基于相同模式， 在理论上可以用于多 数癌细胞的标记。为了进一步证明这种间接免疫荧光法的普适 性，使用探针B对另一种肝癌细胞 Huh 7的表面CEA进行了标 记，结果如图 4 所示。在荧光显微镜下可观察到实验组的肝癌细胞 Huh 7表面发出强烈的红色荧光，说明肝癌细胞 Huh 7表面结合了大量探针 B。 同时，在对照组中，肝癌细胞上几乎未观察到荧光信号，说明探 针 B 与肝癌细胞之间无明显非特异性吸附。 明场和荧光的叠加图 像清楚地表明该探针对癌细胞具有很高的识别效率。 因此，基于 探针B的间接免疫荧光

15、法具有较好的普适性。4结 论制备了羧基和PEG修饰的包裹钉联吡啶二氧化硅荧光纳米 颗粒，设计了两种用亲和素修饰的二氧化硅荧光纳米探针， 并 对肝癌LM 9细胞标记，结果表明：表面修饰 PEG分子的纳米探针能有效地识别癌细胞表面靶蛋白， 从而实现癌细胞的识别和检测。采用此探针成功地对肝癌 Huh7 细胞进行了识别，并验证了 该方法的普适性。References1Chan W C W， Nie S M.Science ， 1998 ， 281 （ 5385）： 2016-20182Tan W H， Wang K M， He X X ， Zhao X J ， Drake T ， Wang，L.Med

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