包裹RuBpy二氧化硅荧光纳米探针的制备及其用于肝癌细胞的识别.docx

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包裹RuBpy二氧化硅荧光纳米探针的制备及其用于肝癌细胞的识别

包裹RuBpy二氧化硅荧光纳米探针的制备及其用于肝癌细胞的识别

1引言

随着纳米技术的迅猛发展，各种各样的纳米材料已被广泛应用于生物分析、物质分离、疾病诊断和治疗等生物医学领域。

荧光纳米材料，如半导体荧光量子点、碳点和包裹染料的二氧化硅纳米颗粒等，通过表面偶联生物功能分子（如抗体或适配体）后，形成具有靶向功能的荧光纳米探针，从而应用于高灵敏的生物分析［1〜7］。

生物分析最常用的标记材料是有机荧光分子，但具有易光漂白、生物相容性较差等缺点，极大地限制了其应用。

为了克服有机荧光染料的上述缺点，开发具有光稳定性的荧光标记材料，成为人们关注的目标。

二氧化硅复合荧光纳米颗粒不仅具有良好的生物相容性、表面易修饰、抗光漂白性、低成本、易分离和良好亲水性等优点［8，9］，而且能够使核酸酶远离固定在其表面的DNA分子，从而保护DNA免受核酸酶的降解［10〜12］。

由于抗体能与抗原特异性结合，目前已有研究将抗体分子偶联到二氧化硅纳米颗粒制备具有靶向性的荧光纳米探针，并将其用于细菌检测、癌细胞识别和抗原检测等方面［13〜17］。

癌胚抗原（CEA是一种分子量为180〜200kDa的多糖蛋白复合物，属于肿瘤细胞表面的结构抗原。

CEA作为一种最常见的肿瘤标志物，被广泛用作各种消化系肿瘤的诊断及监测指标

［18］。

免疫标记成像法是一种常见的原位检测肿瘤标志物的方法，它通过研究细胞膜或细胞内部特定生物化学参数的变化与差异来实现对肿瘤细胞的识别与检测，操作简单、结果直观，在癌症的诊断和转移研究领域具有重要意义。

本实验以肝癌细胞膜表面CEA为靶标，将包裹钉联吡啶

（RuBpy）的二氧化硅复合荧光纳米颗粒表面生物功能化，制备成可进行生物标记的纳米探针，分别用于肝癌细胞LM9、Huh7

的识别与成像。

与染料分子相比，带正电荷的RuBpy分子通过静电作用能够被稳定地束缚在带有负电荷的二氧化硅矩阵里，二氧化硅壳层的保护使自由氧不能接近荧光染料分子。

同时，大量的染料分子被包裹在二氧化硅纳米颗粒核内，从而起到信号放大的作用［19〜21］。

2实验部分

2.1仪器与试剂

二氧化硅纳米颗粒形貌及粒径采用日本JEM100CXII型透射电镜进行测定；官能团表征采用美国Nicolet5700型红外光谱仪测量；细胞成像采用NikonECLIPSETE2000U荧光倒置显微镜。

曲拉通（TritonX100）、环己烷、正己醇、氨水、正硅酸

四乙酯（TEOS、羧基乙基硅烷三醇钠盐（CEOS、\［羟基（聚乙二醇）丙基］三乙氧基硅烷（HPEOPES、1乙基（3二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC、N羟基硫代琥珀酰亚胺

（SulfoNHS、亲和素（Avidin）、2（N吗啡啉乙磺酸（MES、钉联吡啶（Rubpy）,均购于Sigma公司；人肝癌LM9细胞株由武汉大学中南医院提供；人肝癌Huh7细胞株购于中国典型物培养中心；其它试剂均为分析纯，实验用水均采用三次蒸馏水。

2.2表面官能团修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒合成

包裹染料的二氧化硅纳米颗粒合成采用油包水（W/O的反

相微乳法[22]。

首先取1.77mLTritonX100、7.5mL环己烷、1.6mL正己醇和400卩L水，于室温下磁力搅拌10min后形成微乳体系；在此体系中加入80卩L浓度为0.1mol/L钉联吡啶溶液，搅拌5min，加入100卩LTEOS搅拌30min后再加入60卩L氨水在室温下搅拌用于引发形成核壳结构。

24h后，向

体系中加入50卩LTEOS和50卩LCEOS在室温下进一步搅拌12h可以得到羧基修饰的二氧化硅纳米颗粒（RSiNPsCOOH；而PEG修饰的二氧化硅纳米颗粒（RSiNPsPEG则加入100aLTEOS和100aLHPEOPES当反应完成时，用丙酮破乳，最后分别用乙醇和水离心洗涤3次，将得到的纳米颗粒经真空冷冻干燥后备用。

2.3亲和素修饰的二氧化硅荧光纳米探针的制备

2.3.1探针A的制备将1mgEDC、2.5mgSulfoNHS和1mg羧基修饰的纳米颗粒一起加入到1mL0.1mol/LMES缓冲液中，并在室温下活化反应15min。

整个溶液经离心洗涤后重新分散在1mLPBS缓冲液（pH7.4）中，立即加入50aL1g/L亲和素后，在室温下置于摇床反应2h，随后向溶液中加入100

卩L含有2%牛血清蛋白的PBS缓冲液封闭1h。

待反应完成后，经离心洗涤后亲和素修饰的纳米颗粒被重新分散在PBS缓冲液

（pH7.4）中，并在4C下保存备用。

2.3.2探针B的制备

将1mgPEG修饰的纳米颗粒分散到1mL2mol/LNa2CO3缓冲液中，充分混匀后，立即加入1mL溴化氰的乙腈溶液（0.8g/mL），室温下搅拌15min，经活化的纳米颗粒用冰水和PBS缓冲液（pH7.4）各洗2次后，分散到1mLPBS缓冲液，立即向溶液中加入50卩L1mg/mL亲和素，置于4°C反应24h,待反应完成后加入100卩L含有2%牛血清蛋白的PBS缓冲液，在4C过夜。

经过反复离心洗涤后亲和素修饰的纳米颗粒被重新分散在PBS缓冲液（pH7.4）中，并在4C下保存备用。

2.4

肝癌细胞的培养与识别

2.4.1肝癌细胞的培养将肝癌细胞LM9、Huh7用DME培养基（含10%小牛血清、100mg/L链霉素和100mg/L青霉素）吹散，于5%CO237C培养箱中培养。

待细胞铺满培养瓶底部90%寸，用1mL1%胰蛋白酶消化液处理细胞1〜3min，待细胞脱离培养瓶壁，加入9mLDME培养基，待细胞吹匀后将其平均分装在两个培养瓶中。

取一定体积的细胞接种于96孔培养板中继续培养，培养至细胞密度达到50%〜80%寸用于实验。

培养

与传代寸所用器皿及试剂均进行过高压灭菌或过滤除菌。

2.4.2肝癌细胞LM9的识别

分别取100卩L探针A和探针B到已固定好LM9细胞的培养板中，并在每孔补加100卩LPBS缓冲液（pH7.4）置于37C下孵育2h，孵育完成后，再用PBS缓冲液洗涤3次，以除去没有反应的探针。

对照组与实验组操作的区别在于前者不加兔抗CEA抗体。

2.4.3肝癌细胞Huh7的识别

取100卩L探针B到已固定好Huh7细胞的培养板中，并在每孔补加100卩LPBS缓冲液（pH7.4）置于37C下孵育2h,孵育完成后，再用PBS缓冲液洗涤3次，以除去没有反应的探针。

对照组与实验组操作的区别在于前者不加兔抗CEA抗体。

3结果与讨论

3.1二氧化硅荧光纳米颗粒大小形貌表征

采用透射电镜对合成的羧基和PEG修饰的二氧化硅的进行了表征，从图1可见，羧基和PEG修饰纳米颗粒都有很均一的尺寸，粒径约为60nm。

此外，通过高分辨电镜可以明显地观察到包裹荧光染料二氧化硅纳米颗粒的核壳结构。

3.2荧光光谱和红外表征

实验表明，荧光染料RuBpy溶液的荧光发射光谱的最大发射波长为610nm,本研究制备的两种包裹RuBpy的荧光纳米颗粒RSiNPsCOOI和RSiNPsPEG均发射明亮的红色荧光，其最大发射波长分别为609和610nm因此，二氧化硅基本上不影响RuBpy的荧光发射光谱。

通过红外光谱对二氧化硅球表面的官能团进行了证实，结果如图2所示。

特征峰归属如下：

3400cm

Symbolm1左右的为OH的反对称伸缩振动和对称伸缩振动，1100cm

Symbolm1附近的吸收峰为亚甲基的伸缩振动，证明二氧化硅复合纳米颗粒表面已分别成功修饰上了羧基和PEG。

3.3肝癌细胞识别和成像

采用间接免疫荧光法对肝癌细胞表面的CEA进行标记，并通

过抗原抗体、生物素亲和素之间的特异性结合来实现对靶标的免疫荧光标记成像，从而实现对肝癌细胞的识别。

分别使用

RSiNPsCOOHRSiNPsPEG乍为信号指示探针对肝癌细胞LM9表面的CEA进行标记。

为了考察纳米探针是通过抗原抗体特异性靶向模式与肝癌细胞结合，还是通过非特异性吸附于肝癌细胞表面，设置了对照组实验：

以PBS代替兔抗CEA抗体IgG。

探针A和探针B对LM9中CEA的标记结果如图3所示。

在探针A对细胞的识别实验组中，在荧光图像中可观察到部分肝癌细胞LM9表面发出了红色荧光，而在明场和荧光的叠加图像中，部分细胞并未发出红色的荧光，这可能是因为探针A与细胞之间存在空间位阻，仅有部分细胞被标记。

而在探针B的识别实验组中，荧光显微镜下可观察到绝大部分肝癌细胞LM9表

面发出了强烈的红色荧光，在明场和荧光场的叠加图中绝大部分的细胞均发出了红色荧光，说明了肝癌细胞LM9表面结合了大量的探针B。

在相应的对照组中，肝癌细胞几乎没有荧光信号，说明探针B与肝癌细胞之间无明显的非特异性吸附。

这表明探针

B是以抗体抗原结合模式结合到肝癌细胞表面的，同时也说明在avidin与PRSiNPs之间的PEG分子，极大地提高了Avidin分子的自由度和活性[23，24]。

上述方法具有普适性，基于相同模式，在理论上可以用于多数癌细胞的标记。

为了进一步证明这种间接免疫荧光法的普适性，使用探针B对另一种肝癌细胞Huh7的表面CEA进行了标记，结果如图4所示。

在荧光显微镜下可观察到实验组的肝癌细胞Huh7表面发出

强烈的红色荧光，说明肝癌细胞Huh7表面结合了大量探针B。

同时，在对照组中，肝癌细胞上几乎未观察到荧光信号，说明探针B与肝癌细胞之间无明显非特异性吸附。

明场和荧光的叠加图像清楚地表明该探针对癌细胞具有很高的识别效率。

因此，基于探针B的间接免疫荧光法具有较好的普适性。

4结论

制备了羧基和PEG修饰的包裹钉联吡啶二氧化硅荧光纳米颗粒，设计了两种用亲和素修饰的二氧化硅荧光纳米探针，并对肝癌LM9细胞标记，结果表明：

表面修饰PEG分子的纳米探

针能有效地识别癌细胞表面靶蛋白，从而实现癌细胞的识别和检

测。

采用此探针成功地对肝癌Huh7细胞进行了识别，并验证了该方法的普适性。

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