藻类保健品中藻蓝蛋白的盐析提取技术研究.doc

1、2008级生物工程专业毕业论文 学校代码： 11059 学 号： 0802012040 Hefei University 本科毕业论文 BACHELOR DISSERTATION 论文题目：藻类保健品中藻蓝蛋白的盐析提取技术研究学位类别： 工学学士 学科专业： 生物工程 作者姓名： 导师姓名： 夏潇潇 完成时间： 二零一二年五月 目 录摘 要Abstract1 引言11.1 螺旋藻的简介11.2 藻蓝蛋白介绍21.3 藻蓝蛋白的提取方法21.4 研究的意义、目的和内容31.4.1 研究的意义31.4.2 研究的目的31.4.3 研究的内容32 材料与方法42.1 原料和仪器42.1.1 原料4

2、2.1.2 主要仪器42.1.3 主要试剂42.2 实验方法52.2.1 原料中总蛋白质含量的测定52.2.2 螺旋藻的前处理及藻蓝蛋白计算52.2.3不同盐的提取实验62.2.4 冻融次数实验62.2.5 盐浓度实验62.2.6 提取次数实验73 结果与分析83.1 原料中总蛋白质含量结果与分析83.2 不同盐的提取实验结果与分析83.3 盐浓度实验结果与分析93.4 冻融次数实验结果与分析133.5 提取次数实验结果与分析183.6 总结225 结论23参考文献24致谢26摘 要本文对螺旋藻精片中藻蓝蛋白的提取工艺进行研究，考察不同盐、不同浓度、冻融次数、提取次数对藻蓝蛋白提取率的影响。可

3、知：针对不同盐的最佳提取条件分别为：氯化钠：浓度30%，冻融次数6次，提取次数3次；磷酸钾：浓度50%，冻融次数6次，提取次数4次；硫酸铵：浓度40%，冻融次数6次，提取次数6次；硝酸钾：浓度40%，冻融次数8次，提取次数6次。在最优提取条件下，氯化钠、磷酸钾、硫酸铵和硝酸钾的提取率分别为11.00%、10.87%、11.767%和10.837%，其中硫酸铵的提取率最高，可将约98%的藻蓝蛋白提取出来。关键词：藻蓝蛋白；盐析；冻融；提取；得率Abstractthis article research about the extraction process of Spirulina film

4、and the extraction rate of different salts, different concentration, freezing and thawing times, the number of extraction; I Against the best Extracting conditions, respectively Sodium chloride: 30% concentration, freezing and thawing 6 times, three times the number of extraction; Potassium phosphat

5、e: 50% concentration, freezing and thawing 6 times, and extracted 4 times; Ammonium sulfate: 40% concentration, freezing and thawing 6 times, six times the number of extraction; Potassium nitrate: 40% concentration, freezing and thawing times eight times, six times the number of extraction. Under th

6、e best extracting condition, the extraction rate of Sodium chloride; Potassium phosphate; Ammonium sulfate; Potassium nitrate are 11.00%.10.87%.11.767% and 10.837%,respectively.Ammonium ,sulfate can be extracted. The extraction rate about 98% of the phycocyanin .Key words： phycocyanin; salting; free

7、zing and thawing; extraction; yield271 引 言1.1 螺旋藻的简介螺旋藻（如图1），是存在于地球已逾30亿年的低等水生藻类植物，属于蓝藻门，颤藻科。它们与细菌一样，细胞内没有真正的细胞核，所以又称蓝细菌。蓝藻的细胞结构原始，且非常简单，是地球上最早出现的光合生物，其外观为蓝绿色，显微镜观察呈螺旋状，故而得其名1。在非洲的乍得湖和墨西哥的Texcoco湖畔（图2），当地居民用螺旋藻作为食物来源已有一百年的历史。螺旋藻因其丰富、优质的蛋白质而被联合国粮农组织和世界食品协会誉为“人类最理想和最优秀的食品”；国际儿童基金会则称“螺旋藻可以安全根除儿童营养不良”；C

8、lement博士称其为大自然为人类早就准备好的一份“超级营养包”、“微型的营养宝库”；1973年第二届国际微生物蛋白质会议确认“螺旋藻是最佳蛋白质来源之一”、“螺旋藻是人类迄今为止所发现的最优秀的纯天然保健食品源”2。 图 1显微镜下的螺旋藻 图2螺旋藻的生长地 螺旋藻主要以干粉形式直接应用食品行业，其蛋白质含量为56%77%；总脂肪含量约7%，脂肪酸为5.7%，并且其中大多为多不饱和脂肪酸，亚油酸、-亚麻酸，螺旋藻中碳水化合物的含量为16.5%,并含有丰富的多糖2；维生素B1.55mg/kg、维生素B2.40mg/kg、维生素B6.3mg/kg、维生素B12.2mg/kg、泛酸11mg/kg

9、、叶酸0.5mg/kg、烟酸113mg/kg、肌醇350mg/kg、生物素0.4mg/kg、维生素E190mg/kg、胡萝卜素4000mg/kg 3-7。螺旋藻是超碱性食品，可维持血液中酸碱值的平衡，降低胆固醇，减轻高血压和心脏病症状或减少其发病几率；有效改善胃病症状，对抗各种腹泻和便秘，防治贫血，帮助脂肪代谢，有效对抗心脑血管疾病，预防脂肪肝和肝硬化，降低血糖，预防糖尿病；预防因服用镇定剂、抗生素、抗癌剂等对肾机能的损害；减轻汞及药物对肾的毒性，使人体免受重金属的毒害；减肥，美容，去暗疮、黄褐斑，抗衰老。螺旋藻中尤以蛋白质含量最为丰富，是大豆蛋白质的两倍，是目前已知植物中蛋白质含量最高的一种

10、4-6。1.2 藻蓝蛋白的介绍螺旋藻中的蛋白质被称为藻蓝蛋白体，它由多种藻蓝蛋白及连接蛋白或多肽组成，藻蓝蛋白是强荧光的色素-蛋白络合物，能捕获光能。根据他们存在的不同发色团又把藻蓝蛋白分为三大类11：藻红蛋白(吸光度480570nm)、藻蓝蛋白(吸光度590630nm)、藻红蓝蛋白(吸光度560600nm)和别藻蓝蛋白(吸光度620665nm)。其中藻蓝蛋白占总藻蓝蛋白中的20%左右。藻蓝蛋白包含了一个蛋白和一个发色团，而蛋白是由分子量分别在18Ku和20Ku的和亚基组成。藻蓝蛋白是一种重要的藻蓝蛋白，参与藻类高效的光传递过程，分离纯化藻蓝蛋白对于研究其结构以及模拟其生理功能有重要意义，作为

11、一种荧光物质，藻蓝蛋白在生物标记等方面也有广阔的应用前景12。1.3藻蓝蛋白的提取方法螺旋藻受其细胞壁的保护，采用机械方法很难达到破壁效果，所以目前提取藻蓝蛋白的方法通常有采用化学破壁法、溶胀法和反复冻融法等13-16。化学破壁法：是用化学缓冲液破坏细胞壁后提取藻蓝蛋白的方法。虽然它可有效破壁，但也给下一步分离造成了很大麻烦，需要花费较多的工序，使运行成本大幅上升。溶胀法：是利用原料溶解，在一定条件下膨胀的性质进行破碎的方法。该种方法需要的实验周期较长，实验条件要求高。超声法：是利用超声波粉碎技术控制仪器的频率、能量和波发射间歇周期，经过一定时间来使细胞破碎。该方法操作简单，易控制，但单一使用

12、此方法，必须使用高能量、低频率的超声仪才能达到理想的细胞破碎率，这会增加成本。反复冻融法：是将含有水分的螺旋藻置于0以下冻结成冰，然后取出在0以上解冻，利用水在-2027的膨胀特性，破壁析出藻蓝蛋白。这种技术完全采用了物理方法将螺旋藻的细胞壁破裂，不使用任何化学添加剂，同时耗费的能源很少，因此方法很简单，容易实施，保全了螺旋藻的固有成分，藻蓝蛋白的生物活性不受破坏。此方法所需要的设备简单，整个破壁工序需要的时间短，可大大提高生产效率，降低成本。蛋白质的提取多用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硝酸钾、氯化钠、磷酸钾等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大，在这一溶解度范围内，许多

13、蛋白质和酶都可以盐析出来。1.4 研究的意义、目的和内容1.4.1 研究的意义藻蛋白是当前研究的热点，如何提高螺旋藻蛋白的提取率是拓宽螺旋藻应用的一个关键。本文以反复冻融法破碎螺旋藻细胞，辅以超声提取技术，实现更快速更高效的藻蓝蛋白提取率，为螺旋藻蛋白质的充分利用提供研究基础。1.4.2 研究的目的本文以反复冻融法破碎螺旋藻细胞，辅以超声提取技术，考察不同提取条件对藻蓝蛋白提取率的影响，确定最佳的提取条件，建立藻蓝蛋白盐析提取工艺路线。1.4.3 研究的内容（1）原料中总蛋白质含量的测定。（2）不同盐、不同浓度、冻融次数、提取次数对藻蓝蛋白提取率的影响。2 材料和方法2.1 材料与方法2.1.

14、1 原料原料名称 生产厂家 产品批号螺旋藻精片 云南白药-千草堂 Q/YBZ 0002S-20112.1.2 主要仪器仪器名称 生产厂家KDC160HR型高速冷冻离心机 上海博讯实业有限公司医疗设备厂HF-2.5B脉冲超声循环提取机 北京弘祥隆生物技术开发有限公司ATN-300型全自动凯氏定氮仪 上海洪纪仪器设备有限公司 电子天平 德国赛多利斯股份有限公司 752分光光度计 合肥正鑫仪器设备有限公司 福意联电冰箱 北京福意电器有限责任公司HH型恒温水浴锅 巩义市科瑞有限公司2.1.3 主要试剂主要试剂 生产厂家硫酸铵 国药集团化学试剂有限公司磷酸钾盐 国药集团化学试剂有限公司浓硫酸 国药集团化

15、学试剂有限公司硫酸铜 国药集团化学试剂有限公司氯化钠 国药集团化学试剂有限公司硝酸钾 国药集团化学试剂有限公司2.2实验方法2.2.1原料中总蛋白质含量的测定实验采用的为凯氏定氮法。主要分为两个部分组成：(1) 消化：称取0.2g样品粉末，精确至0.001g，移入干燥的25mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜、6g硫酸钾，再加入20mL浓硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45角斜支于有小孔的石棉网上，在温度约100小心预热2h，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，升高温度至350，并保持瓶内溶液微沸状态，待溶液由黑色变为棕黄色，再变为蓝绿色并澄清后，再继续加热1h。取下冷却，小心加入20mL纯净水

16、。放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。(2) 测氮：将装有消化溶液的定氮瓶放入定氮仪，接通冷凝水开启仪器经过加碱、硼酸、加热、酸化、滴定，最终的到样品中的蛋白质含量。有机物中的胺根在强热和CuSO4、浓H2SO4作用，消化生成(NH4)2SO4。(3) 测定：用已知浓度的H2SO4标准溶液滴定，根据HCL消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。2.2.2 螺旋藻前处理及藻蛋白计算公式将螺旋藻片研磨成粉末后，取25g置500mL去离子水中浸泡，于025C反复冻融，再将破碎的螺旋藻细胞悬浊液离心，收集上清液，即为含

17、藻蛋白的提取液，此为粗提液11-12。藻蓝蛋白的特征吸收在620nm，异藻蓝蛋白的特征吸收在650nm处，藻蓝蛋白浓度(C)的计算公式为： (1)藻蓝蛋白提取得率(T)计算公式为： (2)其中，N为样品稀释倍数；V为提取液总体积V，单位mL;G为原料质量，单位mg。蛋白质的计算公式为：粗蛋白的含量：。式中：N为含氮量 ； (3)M=标准酸的摩尔浓度(mol/mL)；W=样品的重量(g)；V0=空白样滴定标准酸量消耗量（mL）；V=样品滴定标准酸消耗量（mL）；C=粗蛋白转换系数。2.2.3不同盐的提取实验取3只试管分别加入粗提液5mL，加入20%的盐溶液（盐分别为：硫酸铵、氯化钠、磷酸钾和硝酸

18、钾）2mL、，再加入3mL去离子水，充分摇晃溶解完全后，反复冻融6次，超声水浴提取2次，每次15分钟。将试管中溶液装入5mL离心管中，室温（或0）静置4h以上，对称放入离心机离心，取去上清液。用紫外分光光度计测量吸光度，根据公式计算各管中藻蓝蛋白浓度，算出得率。以盐的种类为横坐标，藻蓝蛋白的得率为纵坐标，作图。2.2.4 提取次数实验取3只试管分别加入粗提取液5mL，加入20%盐溶液（盐分别为：硫酸铵、氯化钠、磷酸钾和硝酸钾）2mL、，再加入3mL去离子水，充分摇晃溶解完全后，反复冻融2、4、6、8、10次超声水浴提取2次，每次15分钟。将试管中溶液装入5mL离心管中，室温（或0）静置4h以上

19、，对称放入离心机离心，取去上清液。用紫外分光光度计测量吸光度，根据公式计算各管中藻蓝蛋白浓度，算出得率。以冻融次数为横坐标，藻蓝蛋白的得率为纵坐标，作图。2.2.5盐浓度实验取3只试管分别加入粗提取液5mL，加入20%、30%、40%、50%、60%、盐溶液（盐分别为：硫酸铵、氯化钠、磷酸钾和硝酸钾）2mL、，再加入3mL去离子水，充分摇晃溶解完全后，反复冻融6次超声水浴提取2次，每次15分钟。将试管中溶液装入5mL离心管中，室温（或0）静置4h以上，对称放入离心机离心，取去上清液。用紫外分光光度计测量吸光度，根据公式计算各管中藻蓝蛋白浓度，算出得率。以盐浓度为横坐标，藻蓝蛋白的得率为纵坐标，

20、作图。2.2.6提取次数实验取3只试管分别加入粗提取液5mL，加入20%盐溶液（盐分别为：硫酸铵、氯化钠、磷酸钾和硝酸钾）2mL、，再加入3mL去离子水，充分摇晃溶解完全后，反复冻融6次超声水浴提取1、2、3、4次，每次15分钟。将试管中溶液装入5mL离心管中，室温（或0）静置4h以上，对称放入离心机离心，取去上清液。用紫外分光光度计测量吸光度，根据公式计算各管中藻蓝蛋白浓度，算出得率。以提取时间为横坐标，藻蓝蛋白的得率为纵坐标作图。3 结果与分析3.1 原料中总蛋白质含量凯式定氮处理得螺旋藻原料中蛋白质含量为60.63%。根据资料文献报道，藻蓝蛋白占藻总蛋白的20%左右，即，此样品中藻蓝蛋白

21、含量约为12%。3.2 盐的同浓度下实验结果与分析实验考查了硫酸铵、氯化钠、磷酸钾和硝酸钾对藻蓝蛋白提取率的影响，实验结果见表1。表1不同盐的提取实验结果得率（%）氯化钠磷酸钾硫酸铵硝酸钾平行样1平行样2平行样39.0210.5610.9910.119.1210.0610.259.8810.559.769.5010.33平均值10.199.76410.2279.8649.59.69.79.89.91010.110.210.3藻蓝蛋白得率%氯化钠磷酸钾硫酸铵硝酸钾 盐种类图3溶剂种类对藻蓝蛋白得率的影响由图3可知，不同种类的盐对螺旋藻中藻蓝蛋白的提取率差异不大，因此有必要针对每种盐进行盐析提取条

22、件的研究。这是因为不同盐要求的提取条件不一样，藻内还含有其他物质，实验技术不成熟。3.3 盐浓度实验结果与分析实验考查了硫酸铵、氯化钠、磷酸钾和硝酸钾浓度对藻蓝蛋白提取率的影响实验结果见表2。表2不同浓度氯化钠的实验结果得率（%）氯化钠浓度20%30%40%50%60%平行样1平行样2平行样3平均值9.0210.5610.9910.1910.5510.62410.9810.7810.889.2610.6910.27710.589.2610.1810.0010.169.1210.189.829.69.81010.210.410.610.81120%30%40%50%60%70%氯化钠浓度藻蓝蛋白

23、得率%图4 氯化钠浓度对藻蓝蛋白溶出率的影响从图4可以看出，随着氯化钠浓度的升高，蛋白溶出率也在逐渐上升，但达到40后就呈下降趋势。因此，以浓度为30的氯化钠溶液为溶剂得到的藻蓝蛋白得率最高，达到了10.78。表3不同浓度磷酸钾的实验结果得率（%）磷酸钾浓度20%30%40%50%60%平行样1平行样2平行样3平均值10.119.1210.069.76410.269.779.869.97410.339.5210.6910.1810.889.2610.6910.27710.169.1110.069.7779.79.89.91010.110.210.310.420%30%40%50%60%70%磷

24、酸钾浓度藻蓝蛋白得率 %图 5 磷酸钾浓度对藻蓝蛋白得率的影响从图5可以看出，随着磷酸钾浓度的升高，蛋白溶出率也在逐渐上升，但达到50后就呈下降趋势。因此以浓度为50左右的硫酸铵溶液为溶剂得到的藻蓝蛋白得率最高，达到了10.277。表4不同浓度硫酸铵的实验结果得率（%）硫酸铵浓度20%30%40%50%60%平行样1平行样2平行样3平均值10.259.8810.5510.22710.3610.8810.7410.6611.1310.6810.8910.9010.889.4010.9810.4210.449.1610.139.919.81010.210.410.610.81120%30%40%5

25、0%60%70%硫酸铵浓度藻蓝蛋白得率%图 6 硫酸铵浓度对藻蓝蛋白得率的影响曲线从图6可以看出，随着硫酸铵浓度的升高，蛋白得率也在逐渐上升，但达到30后就呈下降趋势。因此以浓度为40的硫酸铵溶液为溶剂得到的藻蓝蛋白得率最高，达到了10.90。表5不同浓度硝酸钾的实验结果得率（%）硝酸钾浓度20%30%40%50%60%平行样1平行样2平行样3平均值9.769.5010.339.86410.0210.379.539.97310.8710.2310.0710.3910.339.4010.139.95310.229.1610.029.8图 7 硝酸钾浓度对藻蓝蛋白得率的影响曲线从图7可以看出，随着

26、硫酸铵浓度的升高，蛋白得率也在逐渐上升，但达到30后就呈下降趋势。因此，以浓度为40的硝酸钾溶液为溶剂得到的藻蓝蛋白得率最高，达到了10.39。9.69.81010.210.410.610.81120%30%40%50%60%70%盐浓度（%）藻蓝蛋白得率%氯化钠盐析曲线磷酸钾盐析曲线硫酸铵盐析曲线硝酸钾盐析曲线图8不同盐、不同盐浓度对藻蓝蛋白得率的影响曲线由图8可知，用不同的盐提取藻蓝蛋白，有各自的最佳浓度，这与盐的提取能力有关。通过比较发现，40%的硫酸铵提取率相对较高，可以达到10.90%。3.4冻融次数实验结果与分析实验考查了硫酸铵、氯化钠、磷酸钾和硝酸钾冻融次数对藻蓝蛋白提取率的影响实验结果见表6。表6不同冻融次数氯化钠的实验结果得率（%）冻融次数/次246810平行样1平行样2平行样3平均值9.439.8810.339.8810.0010.399.539.9739.0210.5610.9910.1910.3310.2610.1310.2410.2210.4310.1310.279.859.99.951010.0510.110.1510.210.25