藻类保健品中藻蓝蛋白的盐析提取技术研究.doc
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2008级生物工程专业毕业论文
学校代码：
11059
学号：
0802012040
HefeiUniversity
本科毕业论文
BACHELORDISSERTATION
论文题目：
藻类保健品中藻蓝蛋白的盐析提取技术研究
学位类别：
工学学士
学科专业：
生物工程
作者姓名：
导师姓名：
夏潇潇
完成时间：
二零一二年五月
目录
摘要 Ⅰ
Abstract Ⅱ
1引言 1
1.1螺旋藻的简介 1
1.2藻蓝蛋白介绍 2
1.3藻蓝蛋白的提取方法 2
1.4研究的意义、目的和内容 3
1.4.1研究的意义 3
1.4.2研究的目的 3
1.4.3研究的内容 3
2材料与方法 4
2.1原料和仪器 4
2.1.1原料 4
2.1.2主要仪器 4
2.1.3主要试剂 4
2.2实验方法 5
2.2.1原料中总蛋白质含量的测定 5
2.2.2螺旋藻的前处理及藻蓝蛋白计算 5
2.2.3不同盐的提取实验 6
2.2.4冻融次数实验 6
2.2.5盐浓度实验 6
2.2.6提取次数实验 7
3结果与分析 8
3.1原料中总蛋白质含量结果与分析 8
3.2不同盐的提取实验结果与分析 8
3.3盐浓度实验结果与分析 9
3.4冻融次数实验结果与分析 13
3.5提取次数实验结果与分析 18
3.6总结 22
5结论 23
参考文献 24
致谢 26
摘要
本文对螺旋藻精片中藻蓝蛋白的提取工艺进行研究，考察不同盐、不同浓度、冻融次数、提取次数对藻蓝蛋白提取率的影响。
可知：
针对不同盐的最佳提取条件分别为：
氯化钠：
浓度30%，冻融次数6次，提取次数3次；磷酸钾：
浓度50%，冻融次数6次，提取次数4次；硫酸铵：
浓度40%，冻融次数6次，提取次数6次；硝酸钾：
浓度40%，冻融次数8次，提取次数6次。
在最优提取条件下，氯化钠、磷酸钾、硫酸铵和硝酸钾的提取率分别为11.00%、10.87%、11.767%和10.837%，其中硫酸铵的提取率最高，可将约98%的藻蓝蛋白提取出来。
关键词：
藻蓝蛋白；盐析；冻融；提取；得率
Abstract
thisarticleresearchabouttheextractionprocessofSpirulinafilmandtheextractionrateofdifferentsalts,differentconcentration,freezingandthawingtimes,thenumberofextraction;IAgainstthebestExtractingconditions,respectively①Sodiumchloride:
30%concentration,freezingandthawing6times,threetimesthenumberofextraction;②Potassiumphosphate:
50%concentration,freezingandthawing6times,andextracted4times;③Ammoniumsulfate:
40%concentration,freezingandthawing6times,sixtimesthenumberofextraction;④Potassiumnitrate:
40%concentration,freezingandthawingtimeseighttimes,sixtimesthenumberofextraction.Underthebestextractingcondition,theextractionrateofSodiumchloride;Potassiumphosphate;Ammoniumsulfate;Potassiumnitrateare11.00%.10.87%.11.767%and10.837%,respectively.Ammonium,sulfatecanbeextracted.Theextractionrateabout98%ofthephycocyanin.
Keywords：
phycocyanin;salting;freezingandthawing;extraction;yield
27
1引言
1.1螺旋藻的简介
螺旋藻（如图1），是存在于地球已逾30亿年的低等水生藻类植物，属于蓝藻门，颤藻科。
它们与细菌一样，细胞内没有真正的细胞核，所以又称蓝细菌。
蓝藻的细胞结构原始，且非常简单，是地球上最早出现的光合生物，其外观为蓝绿色，显微镜观察呈螺旋状，故而得其名[1]。
在非洲的乍得湖和墨西哥的Texcoco湖畔（图2），当地居民用螺旋藻作为食物来源已有一百年的历史。
螺旋藻因其丰富、优质的蛋白质而被联合国粮农组织和世界食品协会誉为“人类最理想和最优秀的食品”；国际儿童基金会则称“螺旋藻可以安全根除儿童营养不良”；Clement博士称其为大自然为人类早就准备好的一份“超级营养包”、“微型的营养宝库”；1973年第二届国际微生物蛋白质会议确认“螺旋藻是最佳蛋白质来源之一”、“螺旋藻是人类迄今为止所发现的最优秀的纯天然保健食品源”[2]。
图1显微镜下的螺旋藻图2螺旋藻的生长地
螺旋藻主要以干粉形式直接应用食品行业，其蛋白质含量为56%~77%；总脂肪含量约7%，脂肪酸为5.7%，并且其中大多为多不饱和脂肪酸，亚油酸、γ-亚麻酸，螺旋藻中碳水化合物的含量为16.5%,并含有丰富的多糖[2]；维生素B1.55mg/kg、维生素B2.40mg/kg、维生素B6.3mg/kg、维生素B12.2mg/kg、泛酸11mg/kg、叶酸0.5mg/kg、烟酸113mg/kg、肌醇350mg/kg、生物素0.4mg/kg、维生素E190mg/kg、胡萝卜素4000mg/kg[3-7]。
螺旋藻是超碱性食品，可维持血液中酸碱值的平衡，降低胆固醇，减轻高血压和心脏病症状或减少其发病几率；有效改善胃病症状，对抗各种腹泻和便秘，防治贫血，帮助脂肪代谢，有效对抗心脑血管疾病，预防脂肪肝和肝硬化，降低血糖，预防糖尿病；预防因服用镇定剂、抗生素、抗癌剂等对肾机能的损害；减轻汞及药物对肾的毒性，使人体免受重金属的毒害；减肥，美容，去暗疮、黄褐斑，抗衰老。
螺旋藻中尤以蛋白质含量最为丰富，是大豆蛋白质的两倍，是目前已知植物中蛋白质含量最高的一种[4-6]。
1.2藻蓝蛋白的介绍
螺旋藻中的蛋白质被称为藻蓝蛋白体，它由多种藻蓝蛋白及连接蛋白或多肽组成，藻蓝蛋白是强荧光的色素-蛋白络合物，能捕获光能。
根据他们存在的不同发色团又把藻蓝蛋白分为三大类[11]：
藻红蛋白（吸光度480~570nm）、藻蓝蛋白（吸光度590~630nm）、藻红蓝蛋白（吸光度560~600nm）和别藻蓝蛋白（吸光度620~665nm）。
其中藻蓝蛋白占总藻蓝蛋白中的20%左右。
藻蓝蛋白包含了一个蛋白和一个发色团，而蛋白是由分子量分别在18Ku和20Ku的α和β亚基组成。
藻蓝蛋白是一种重要的藻蓝蛋白，参与藻类高效的光传递过程，分离纯化藻蓝蛋白对于研究其结构以及模拟其生理功能有重要意义，作为一种荧光物质，藻蓝蛋白在生物标记等方面也有广阔的应用前景[12]。
1.3藻蓝蛋白的提取方法
螺旋藻受其细胞壁的保护，采用机械方法很难达到破壁效果，所以目前提取藻蓝蛋白的方法通常有采用化学破壁法、溶胀法和反复冻融法等[13-16]。
①化学破壁法：
是用化学缓冲液破坏细胞壁后提取藻蓝蛋白的方法。
虽然它可有效破壁，但也给下一步分离造成了很大麻烦，需要花费较多的工序，使运行成本大幅上升。
②溶胀法：
是利用原料溶解，在一定条件下膨胀的性质进行破碎的方法。
该种方法需要的实验周期较长，实验条件要求高。
③超声法：
是利用超声波粉碎技术控制仪器的频率、能量和波发射间歇周期，经过一定时间来使细胞破碎。
该方法操作简单，易控制，但单一使用此方法，必须使用高能量、低频率的超声仪才能达到理想的细胞破碎率，这会增加成本。
④反复冻融法：
是将含有水分的螺旋藻置于0℃以下冻结成冰，然后取出在0℃以上解冻，利用水在-20℃﹣27℃的膨胀特性，破壁析出藻蓝蛋白。
这种技术完全采用了物理方法将螺旋藻的细胞壁破裂，不使用任何化学添加剂，同时耗费的能源很少，因此方法很简单，容易实施，保全了螺旋藻的固有成分，藻蓝蛋白的生物活性不受破坏。
此方法所需要的设备简单，整个破壁工序需要的时间短，可大大提高生产效率，降低成本。
蛋白质的提取多用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硝酸钾、氯化钠、磷酸钾等。
其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大，在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来。
1.4研究的意义、目的和内容
1.4.1研究的意义
藻蛋白是当前研究的热点，如何提高螺旋藻蛋白的提取率是拓宽螺旋藻应用的一个关键。
本文以反复冻融法破碎螺旋藻细胞，辅以超声提取技术，实现更快速更高效的藻蓝蛋白提取率，为螺旋藻蛋白质的充分利用提供研究基础。
1.4.2研究的目的
本文以反复冻融法破碎螺旋藻细胞，辅以超声提取技术，考察不同提取条件对藻蓝蛋白提取率的影响，确定最佳的提取条件，建立藻蓝蛋白盐析提取工艺路线。
1.4.3研究的内容
（1）原料中总蛋白质含量的测定。
（2）不同盐、不同浓度、冻融次数、提取次数对藻蓝蛋白提取率的影响。
2材料和方法
2.1材料与方法
2.1.1原料
原料名称生产厂家产品批号
螺旋藻精片云南白药-千草堂Q/YBZ0002S-2011
2.1.2主要仪器
仪器名称生产厂家
KDC160HR型高速冷冻离心机上海博讯实业有限公司医疗设备厂
HF-2.5B脉冲超声循环提取机北京弘祥隆生物技术开发有限公司
ATN-300型全自动凯氏定氮仪上海洪纪仪器设备有限公司
电子天平德国赛多利斯股份有限公司
752分光光度计合肥正鑫仪器设备有限公司
福意联电冰箱北京福意电器有限责任公司
HH型恒温水浴锅巩义市科瑞有限公司
2.1.3主要试剂
主要试剂生产厂家
硫酸铵国药集团化学试剂有限公司
磷酸钾盐国药集团化学试剂有限公司
浓硫酸国药集团化学试剂有限公司
硫酸铜国药集团化学试剂有限公司
氯化钠国药集团化学试剂有限公司
硝酸钾国药集团化学试剂有限公司
2.2实验方法
2.2.1原料中总蛋白质含量的测定
实验采用的为凯氏定氮法。
主要分为两个部分组成：
（1）消化：
称取0.2g样品粉末，精确至0.001g，移入干燥的25mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜、6g硫酸钾，再加入20mL浓硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上，在温度约100℃小心预热2h，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，升高温度至350℃，并保持瓶内溶液微沸状态，待溶液由黑色变为棕黄色，再变为蓝绿色并澄清后，再继续加热1h。
取下冷却，小心加入20mL纯净水。
放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。
（2）测氮：
将装有消化溶液的定氮瓶放入定氮仪，接通冷凝水开启仪器经过加碱、硼酸、加热、酸化、滴定，最终的到样品中的蛋白质含量。
有机物中的胺根在强热和CuSO4、浓H2SO4作用，消化生成（NH4）2SO4。
（3）测定：
用已知浓度的H2SO4标准溶液滴定，根据HCL消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。
2.2.2螺旋藻前处理及藻蛋白计算公式
将螺旋藻片研磨成粉末后，取25g置500mL去离子水中浸泡，于0~25°C反复冻融，再将破碎的螺旋藻细胞悬浊液离心，收集上清液，即为含藻蛋白的提取液，此为粗提液[11-12]。
藻蓝蛋白的特征吸收在620nm，异藻蓝蛋白的特征吸收在650nm处，藻蓝蛋白浓度（C）的计算公式为：
（1）
藻蓝蛋白提取得率（T）计算公式为：
（2）
其中，N为样品稀释倍数；V为提取液总体积V，单位mL;G为原料质量，单位mg。
蛋白质的计算公式为：
粗蛋白的含量：
。
式中：
N为含氮量；（3）
M=标准酸的摩尔浓度（mol/mL）；
W=样品的重量（g）；
V0=空白样滴定标准酸量消耗量（mL）；
V=样品滴定标准酸消耗量（mL）；
C=粗蛋白转换系数。
2.2.3不同盐的提取实验
①取3只试管分别加入粗提液5mL，加入20%的盐溶液（盐分别为：
硫酸铵、氯化钠、磷酸钾和硝酸钾）2mL、，再加入3mL去离子水，充分摇晃溶解完全后，反复冻融6次，超声水浴提取2次，每次15分钟。
②将试管中溶液装入5mL离心管中，室温（或0℃）静置4h以上，对称放入离心机离心，取去上清液。
③用紫外分光光度计测量吸光度，根据公式计算各管中藻蓝蛋白浓度，算出得率。
④以盐的种类为横坐标，藻蓝蛋白的得率为纵坐标，作图。
2.2.4提取次数实验
①取3只试管分别加入粗提取液5mL，加入20%盐溶液（盐分别为：
硫酸铵、氯化钠、磷酸钾和硝酸钾）2mL、，再加入3mL去离子水，充分摇晃溶解完全后，反复冻融2、4、6、8、10次超声水浴提取2次，每次15分钟。
②将试管中溶液装入5mL离心管中，室温（或0℃）静置4h以上，对称放入离心机离心，取去上清液。
③用紫外分光光度计测量吸光度，根据公式计算各管中藻蓝蛋白浓度，算出得率。
④以冻融次数为横坐标，藻蓝蛋白的得率为纵坐标，作图。
2.2.5盐浓度实验
①取3只试管分别加入粗提取液5mL，加入20%、30%、40%、50%、60%、盐溶液（盐分别为：
硫酸铵、氯化钠、磷酸钾和硝酸钾）2mL、，再加入3mL去离子水，充分摇晃溶解完全后，反复冻融6次超声水浴提取2次，每次15分钟。
②将试管中溶液装入5mL离心管中，室温（或0℃）静置4h以上，对称放入离心机离心，取去上清液。
③用紫外分光光度计测量吸光度，根据公式计算各管中藻蓝蛋白浓度，算出得率。
④以盐浓度为横坐标，藻蓝蛋白的得率为纵坐标，作图。
2.2.6提取次数实验
①取3只试管分别加入粗提取液5mL，加入20%盐溶液（盐分别为：
硫酸铵、氯化钠、磷酸钾和硝酸钾）2mL、，再加入3mL去离子水，充分摇晃溶解完全后，反复冻融6次超声水浴提取1、2、3、4次，每次15分钟。
②将试管中溶液装入5mL离心管中，室温（或0℃）静置4h以上，对称放入离心机离心，取去上清液。
③用紫外分光光度计测量吸光度，根据公式计算各管中藻蓝蛋白浓度，算出得率。
④以提取时间为横坐标，藻蓝蛋白的得率为纵坐标作图。
3结果与分析
3.1原料中总蛋白质含量
凯式定氮处理得螺旋藻原料中蛋白质含量为60.63%。
根据资料文献报道，藻蓝蛋白占藻总蛋白的20%左右，即，此样品中藻蓝蛋白含量约为12%。
3.2盐的同浓度下实验结果与分析
实验考查了硫酸铵、氯化钠、磷酸钾和硝酸钾对藻蓝蛋白提取率的影响，实验结果见表1。
表1不同盐的提取实验结果
得率（%）
氯化钠
磷酸钾
硫酸铵
硝酸钾
平行样1
平行样2
平行样3
9.02
10.56
10.99
10.11
9.12
10.06
10.25
9.88
10.55
9.76
9.50
10.33
平均值
10.19
9.764
10.227
9.864
9.5
9.6
9.7
9.8
9.9
10
10.1
10.2
10.3
藻
蓝
蛋
白
得
率
%
氯化钠
磷酸钾
硫酸铵
硝酸钾
盐种类
图3溶剂种类对藻蓝蛋白得率的影响
由图3可知，不同种类的盐对螺旋藻中藻蓝蛋白的提取率差异不大，因此有必要针对每种盐进行盐析提取条件的研究。
这是因为不同盐要求的提取条件不一样，藻内还含有其他物质，实验技术不成熟。
3.3盐浓度实验结果与分析
实验考查了硫酸铵、氯化钠、磷酸钾和硝酸钾浓度对藻蓝蛋白提取率的影响实验结果见表2。
表2不同浓度氯化钠的实验结果
得率（%）
氯化钠浓度
20%
30%
40%
50%
60%
平行样1
平行样2
平行样3
平均值
9.02
10.56
10.99
10.19
10.55
10.624
10.98
10.78
10.88
9.26
10.69
10.277
10.58
9.26
10.18
10.00
10.16
9.12
10.18
9.82
9.6
9.8
10
10.2
10.4
10.6
10.8
11
20%
30%
40%
50%
60%
70%
氯化钠浓度
藻蓝蛋白得率
%
图4氯化钠浓度对藻蓝蛋白溶出率的影响
从图4可以看出，随着氯化钠浓度的升高，蛋白溶出率也在逐渐上升，但达到40％后就呈下降趋势。
因此，以浓度为30％的氯化钠溶液为溶剂得到的藻蓝蛋白得率最高，达到了10.78％。
表3不同浓度磷酸钾的实验结果
得率（%）
磷酸钾浓度
20%
30%
40%
50%
60%
平行样1
平行样2
平行样3
平均值
10.11
9.12
10.06
9.764
10.26
9.77
9.86
9.974
10.33
9.52
10.69
10.18
10.88
9.26
10.69
10.277
10.16
9.11
10.06
9.777
9.7
9.8
9.9
10
10.1
10.2
10.3
10.4
20%
30%
40%
50%
60%
70%
磷酸钾浓度
藻蓝蛋白得率%
图5磷酸钾浓度对藻蓝蛋白得率的影响
从图5可以看出，随着磷酸钾浓度的升高，蛋白溶出率也在逐渐上升，但达到50％后就呈下降趋势。
因此以浓度为50％左右的硫酸铵溶液为溶剂得到的藻蓝蛋白得率最高，达到了10.277％。
表4不同浓度硫酸铵的实验结果
得率（%）
硫酸铵浓度
20%
30%
40%
50%
60%
平行样1
平行样2
平行样3
平均值
10.25
9.88
10.55
10.227
10.36
10.88
10.74
10.66
11.13
10.68
10.89
10.90
10.88
9.40
10.98
10.42
10.44
9.16
10.13
9.91
9.8
10
10.2
10.4
10.6
10.8
11
20%
30%
40%
50%
60%
70%
硫酸铵浓度
藻蓝蛋白得率
%
图6硫酸铵浓度对藻蓝蛋白得率的影响曲线
从图6可以看出，随着硫酸铵浓度的升高，蛋白得率也在逐渐上升，但达到30％后就呈下降趋势。
因此以浓度为40％的硫酸铵溶液为溶剂得到的藻蓝蛋白得率最高，达到了10.90％。
表5不同浓度硝酸钾的实验结果
得率（%）
硝酸钾浓度
20%
30%
40%
50%
60%
平行样1
平行样2
平行样3
平均值
9.76
9.50
10.33
9.864
10.02
10.37
9.53
9.973
10.87
10.23
10.07
10.39
10.33
9.40
10.13
9.953
10.22
9.16
10.02
9.8
图7硝酸钾浓度对藻蓝蛋白得率的影响曲线
从图7可以看出，随着硫酸铵浓度的升高，蛋白得率也在逐渐上升，但达到30％后就呈下降趋势。
因此，以浓度为40％的硝酸钾溶液为溶剂得到的藻蓝蛋白得率最高，达到了10.39％。
9.6
9.8
10
10.2
10.4
10.6
10.8
11
20%
30%
40%
50%
60%
70%
盐浓度（%）
藻蓝蛋白得率%
氯化钠盐析曲线
磷酸钾盐析曲线
硫酸铵盐析曲线
硝酸钾盐析曲线
图8不同盐、不同盐浓度对藻蓝蛋白得率的影响曲线
由图8可知，用不同的盐提取藻蓝蛋白，有各自的最佳浓度，这与盐的提取能力有关。
通过比较发现，40%的硫酸铵提取率相对较高，可以达到10.90%。
3.4冻融次数实验结果与分析
实验考查了硫酸铵、氯化钠、磷酸钾和硝酸钾冻融次数对藻蓝蛋白提取率的影响实验结果见表6。
表6不同冻融次数氯化钠的实验结果
得率（%）
冻融次数/次
2
4
6
8
10
平行样1
平行样2
平行样3
平均值
9.43
9.88
10.33
9.88
10.00
10.39
9.53
9.973
9.02
10.56
10.99
10.19
10.33
10.26
10.13
10.24
10.22
10.43
10.13
10.27
9.85
9.9
9.95
10
10.05
10.1
10.15
10.2
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