Q-PCR实验步骤.docx

1、Q-PCR实验步骤测定沉积物中产甲烷菌的数量（1）DNA提取沉积物总DNA根据DNA提取试剂盒(MoBio, Carlsbad, CA)说明书来提取。（2）目的片段PCR扩增引物：mlas(5 -GGTGGTGTMGGDTTCACMCARTA-3) mcrA-rev(5 -CGTTCATBGCGTAGTTVGGRTAGT-3)；扩增片段长度为409 bp。以沉积物总DNA为模板，用甲烷菌特异性引物进行PCR反应。PCR反应体系为（50L）： 10buffer（含Mg2+） 5L dNTP（2.5mmol/L） 4L 上、下游引物（10mol/L） 1L Ex Taq 酶（5U/L） 0.35L

2、 DNA模板（10ng/L） 1L ddH2O 37.65LPCR循环参数：95C预变性3min；接着30个循环为95C变性30 s，55C低温退火45 s，72C延伸30s；72C 延伸10min，4C 保温。（3）重组标准质粒的制备按照琼脂糖凝胶DNA片段回收纯化试剂盒说明对PCR产物进行纯化、回收。按照pMD 19-T载体试剂盒的说明书将纯化的PCR产物与pMD 19-T载体连接。连接体系为：1.2L 水，0.8L PCR产物，0.35L pMD 19-T载体，2.5L Solution （注：按顺序添加，并在冰上操作），于16过夜反应（放PCR仪上）。转化：把感受态细胞（E.coli

3、Competent Cells）置于冰中融化；把25L的感受态细胞移至灭菌处理的离心管内；加入用于转化的DNA（10ng以下）；冰中放置30min；42C放置60s；冰中放置2-3min；加入37C预温好的LB培养基250L；37C振荡培养1h（160-225rpm）；取适量涂布琼脂平板培养基（160L）（先涂150L Amp，干后用前涂80L X-gal）；37C过夜培养，直至可观察到菌落为止；挑选单个白色菌斑至3mL 含Amp的LB培养基，37C 摇菌培养，直至培养液变浑浊。分别以原有 PCR引物（mlas和mcrA-rev）和M13（M13R和M13F）引物对菌液进行扩增，根据扩增特异条

4、带的位置鉴定阳性克隆，抽提两种引物扩增均为阳性的样品，按照质粒 DNA 提取试剂盒的操作要求提取质粒 DNA。 以M13为引物的PCR反应体系为（20L）： 10buffer 2L Mg2+ 1.2L dNTP 1.2L 上、下游引物 0.3L R Taq 酶 0.2L DNA模板 0.2L ddH2O 14.6L（4）实时荧光定量PCR：抽提PCR为阳性克隆的重组质粒DNA，测定其浓度（ng/L），根据各质粒的分子量与质量浓度，计算成拷贝数，制得标准品。将标准品按10倍梯度稀释成105-109，用作模板在实时定量PCR仪上进行扩增，建立反映Ct值与质粒拷贝数浓度对应关系的定量标准曲线。按照试

5、剂盒说明书建立反应体系和反应条件，自动采集荧光。反应体系（20L）： SYBR Premix Ex Taq (2) 10L PCR Forward Primer (mlas) 0.8L PCR Reverse Primer (mcrA-rev) 0.8L DNA 模板 2L ddH2O 6.4L反应条件：PCR循环参数：95C预变性3min；接着30个循环为95C变性30 s，55C低温退火45 s，72C延伸30s； 按仪器操作说明选择熔解曲线分析：95C 15 s，60C 15 s，95C 15 s。参考文献1Steinberg, L. M., and J. M. Regan. 2008.

6、 Phylogenetic comparison of the methanogenic communities from an acidic, oligotrohic fen and an anaerobic digester treating municipal wastewater sludge. Appl. Environ. Microbiol.74:66636671.2Steinberg, L. M., and J. M. Regan. 2009. mcrA-Targeted real-time quantitative PCR method to examine methanogen communities. Appl. Environ. Microbiol. 75(13):4435-4442.3Cai, H., and N. Jiao. 2008. Diversity and abundance of nitrate assimilation genes in the northern SouthChina Sea.Microb Ecol. 56:751-764.