Q-PCR实验步骤.docx

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Q-PCR实验步骤

——测定沉积物中产甲烷菌的数量

（1）DNA提取

沉积物总DNA根据DNA提取试剂盒（MoBio,Carlsbad,CA）说明书来提取。

（2）目的片段PCR扩增

引物：

mlas（5′-GGTGGTGTMGGDTTCACMCARTA-3′）

mcrA-rev（5′-CGTTCATBGCGTAGTTVGGRTAGT-3′）；

扩增片段长度为409bp。

以沉积物总DNA为模板，用甲烷菌特异性引物进行PCR反应。

PCR反应体系为（50μL）：

10×buffer（含Mg2+）5μL

dNTP（2.5mmol/L）4μL

上、下游引物（10μmol/L）1μL

ExTaq酶（5U/μL）0.35μL

DNA模板（10ng/μL）1μL

ddH2O37.65μL

PCR循环参数：

95°C预变性3min；接着30个循环为95°C变性30s，55°C低温退火45s，72°C延伸30s；72°C延伸10min，4°C保温。

（3）重组标准质粒的制备

按照琼脂糖凝胶DNA片段回收纯化试剂盒说明对PCR产物进行纯化、回收。

按照pMD19-T载体试剂盒的说明书将纯化的PCR产物与pMD19-T载体连接。

连接体系为：

1.2μL水，0.8μLPCR产物，0.35μLpMD19-T载体，2.5μLSolutionⅠ（注：

按顺序添加，并在冰上操作），于16℃过夜反应（放PCR仪上）。

转化：

①把感受态细胞（E.coliCompetentCells）置于冰中融化；

②把25μL的感受态细胞移至灭菌处理的离心管内；

③加入用于转化的DNA（10ng以下）；

④冰中放置30min；

⑤42°C放置60s；

⑥冰中放置2-3min；

⑦加入37°C预温好的LB培养基250μL；

⑧37°C振荡培养1h（160-225rpm）；

⑨取适量涂布琼脂平板培养基（160μL）（先涂150μLAmp，干后用前涂80μLX-gal）；

⑩37°C过夜培养，直至可观察到菌落为止；

挑选单个白色菌斑至3mL含Amp的LB培养基，37°C摇菌培养，直至培养液变浑浊。

分别以原有PCR引物（mlas和mcrA-rev）和M13（M13R和M13F）引物对菌液进行扩增，根据扩增特异条带的位置鉴定阳性克隆，抽提两种引物扩增均为阳性的样品，按照质粒DNA提取试剂盒的操作要求提取质粒DNA。

以M13为引物的PCR反应体系为（20μL）：

10×buffer2μL

Mg2+1.2μL

dNTP1.2μL

上、下游引物0.3μL

RTaq酶0.2μL

DNA模板0.2μL

ddH2O14.6μL

（4）实时荧光定量PCR：

抽提PCR为阳性克隆的重组质粒DNA，测定其浓度（ng/μL），根据各质粒的分子量与质量浓度，计算成拷贝数，制得标准品。

将标准品按10倍梯度稀释成105-109，用作模板在实时定量PCR仪上进行扩增，建立反映Ct值与质粒拷贝数浓度对应关系的定量标准曲线。

按照试剂盒说明书建立反应体系和反应条件，自动采集荧光。

反应体系（20μL）：

SYBRPremixExTaqⅡ（2×）10μL

PCRForwardPrimer（mlas）0.8μL

PCRReversePrimer（mcrA-rev）0.8μL

DNA模板2μL

ddH2O6.4μL

反应条件：

PCR循环参数：

95°C预变性3min；接着30个循环为95°C变性30s，55°C低温退火45s，72°C延伸30s；

按仪器操作说明选择熔解曲线分析：

95°C15s，60°C15s，95°C15s。

参考文献

[1]Steinberg,L.M.,andJ.M.Regan.2008.Phylogeneticcomparisonofthemethanogeniccommunitiesfromanacidic,oligotrohicfenandananaerobicdigestertreatingmunicipalwastewatersludge.Appl.Environ.Microbiol.74:

6663–6671.

[2]Steinberg,L.M.,andJ.M.Regan.2009.mcrA-Targetedreal-timequantitativePCRmethodtoexaminemethanogencommunities.Appl.Environ.Microbiol.75（13）:

4435-4442.

[3]Cai,H.,andN.Jiao.2008.DiversityandabundanceofnitrateassimilationgenesinthenorthernSouth ChinaSea. MicrobEcol.56:

751-764.