qpcr步骤.docx

1、qpcr步骤范围和适用性 本实验适用于使用StepOnePlus实时PCR仪对DNA PE、DNA PE Index、SE文库以及Exon Capture组、转录组、表达谱、Small RNA组、表观遗传组等制备的文库进行上机前的精确定量。摘 要 荧光定量PCR实验是以Agilent 2100 Bioanalyzer对文库的检测结果为参照, 使用StepOnePlus实时PCR仪对文库进行定量,得出待测文库浓度，为之后的Cluster制备提供浓度依据。该实验的主要内容包括：（1）梯度稀释标准品；（2）按实验要求稀释样品；（3）配制反应预混液；（4）加样；（5）设置反应程序；（6）运行实验；（7

2、）分析实验结果，计算待测样品浓度。整个流程需要3-4小时。缩写词和SOP中专业术语的解释缩写词或术语解释基线(Baseline)扩增曲线中的水平部分阈值(Threshold)高于基线但处于扩增曲线的指数增长区范围之内的荧光水平。C t 值扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。实验材料及方法1 实验试剂和耗材1.1试剂表1-1 实验所需试剂试剂名称货号生产厂家10 BufferDDR006BTAKARAdNTP(2.5mM)DDR006BTAKARAEX HS TaqDDR006BTAKARATaqMan PE Probe上海生工PE Q-PCR Primer 1.1上海生工In

3、dex Q-PCR Primer RR上海生工SE Q-PCR Primer 1.1上海生工SE Q-PCR Primer 2.1上海生工ROX12223012Invitrogen含ThermoPol缓冲液MgSO4(100mM)B9004SNEBTween20P9416-100MLSIGMADMSODT0163-500ML上海生工BetaineB2629-1KGSIGMASRNA PCR Primer 1上海生工SRNA PCR Primer 2上海生工1.2 耗材表1-2 实验所需耗材耗材型号生产厂家96孔国产光学反应板国产光学封口膜（泛特津）国产0.2ml Sterile, PCR mi

4、crotubesPCR-02D-CAxygen0.6ml离心管MCT-060-CAxygen吸嘴0.5-10ul超微量、袋装T-300Axygen吸嘴200ul黄色吸嘴、袋装T-200-YAxygen吸嘴1000ul蓝色、袋装T-1000-YAxygen1.5ml离心管MCT-150-CAxygen2 实验仪器设备表2-1 实验所需仪器设备设备型号生产厂家StepOne Plus Real-Time PCR System4376592ABI迷你离心机LX-200海门其林贝尔VortexQL901海门其林贝尔微孔板离心机MPS-1000Labnet3 实验操作流程3.1 填写Q-PCR实验登记表

5、 样品的交接按照质控组样品交接管理规程执行。实验前，先在“表单准备区”将要检测的样品在Q-PCR实验登记表中填写好，并根据“文库交接检测”文件夹中_组文库检测结果中的待测样品的顺序按顺序填到Q-PCR实验登记表上，并在右上角注明批次后打印出来。然后将需要检测的样品的样品名和文库号按照Q-PCR实验登记表上的顺序粘贴到“文库核对&存放位置”文件夹中的文库检测前核对表Excel表中，等待核对样品信息。3.2 稀释标准品开始实验前，到-20冰箱和冰柜中将实验所需的标准品和样品取出，并按Q-PCR实验登记表上的顺序排好，并到表单准备区，用扫描枪将样品的文库号扫描到“文库核对&存放位置”文件夹中的文库检

6、测前核对表Excel表中进行核对，核对结果为“错错错错”，则样品不正确需重新找取样品信息相同的样品；核对结果为“对”，则样品正确。核对完样品信息后，将样品和标准品拿到“稀释区”进行稀释。名称移液量超纯水(l)终浓度(pM)Std 1原管(1 nM)不稀释1000Std 22 l (Std 1)18100Std 32 l (Std 2)1810Std 42 l (Std 3)181Std 52 l (Std 4)180.11）取5个0.2 ml PCR 离心管，分别标记为Std 1、Std 2、Std 3、Std 4和Std 5。标准品多于一种时应标明标准品的名称。2）分别吸取18 l超纯水至S

7、td 2、Std 3、Std 4和Std 5离心管。3）使用新Tip移取2 l Std 1至装有18 l 超纯水的Std 2离心管，用Vortex振荡10至15秒，用力用手甩离心管，将壁上的液体甩下。4）使用新Tip移取2 l Std 2至装有18 l 超纯水的Std 3离心管，用Vortex振荡10至15秒，用力用手甩离心管，将壁上的液体甩下。5）使用新Tip移取2 l Std 3至装有18 l 超纯水的Std 4离心管，用Vortex振荡10至15秒，用力用手甩离心管，将壁上的液体甩下。6）使用新Tip移取2 l Std 4至装有18 l 超纯水的Std 5离心管，用Vortex振荡10至

8、15秒，用力用手甩离心管，将壁上的液体甩下。7）将已稀释的标准品置于4 或冰上。【注意】 原管（1nM）的标准品要用时从-20 冰箱中的标准品盒子中取出；不用时应及时放回-20 冰箱中，以防降解。 实验前带上口罩和新手套，并用70%酒精将实验台擦拭一遍。 移液要准确，振荡要充分，振荡前需检查管盖是否盖严。 使用超纯水稀释标准品。3.3 稀释样品1）如果待测文库是需要混合的Index文库，则先按照Q-PCR pooling规则混合好，贴好标签等待检测。2）取和待测样品数量相同的0.6 ml PCR 离心管，分别标记为待测样品名称或者是样品管盖上的记号。3）如果待测样品体积小于15ul（如表达谱、

9、Small RNA组的样品），则分别吸取99 l超纯水至每个离心管中；如果待测样品体积大于15ul，则分别吸取198 l超纯水至每个离心管中。4）将待测文库的样品原管充分振荡，短暂离心后，按照Q-PCR实验登记表上的顺序排好，然后分别移取样品溶液至相对应的装有超纯水的离心管中，如果样品体积小于15ul的，则吸取1ul的样品到装有99ul超纯水的离心管中；如果样品体积大于15ul，则吸取2ul样品到装有198ul超纯水的离心管中。振荡10至15秒，短暂离心。5）将已稀释的样品置于4 或冰上；将样品原管放回-20 冰柜中的编号盒存放，将样品放到编号盒中腾空的位置，并将样品的文库号用扫描枪录入“文库

10、核对&存放位置”文件夹中的上机文库存放位置表Excel表中的对应位置存档。【注意】 移液要准确，振荡要充分，振荡前需检查管盖是否盖严，吸取样品后确保管盖盖严。 使用的超纯水稀释样品。3.4 配制反应预混液1）到隔壁实验室的“Mix配制区”配制反应预混液。取1.5 ml或2 ml离心管，在管盖上标记上Mix，套上锡箔纸。2）按以下反应体系准备反应预混液（以8个PE样品、1条标准曲线和10个SE样品、2条标准曲线为例）：表3-4-1 PE Mix的配置组分1次反应所需用量（l）37次反应所需用量（l）PE Mix7.05260.85dNTP(2.5mM)0.829.6Probe0.259.25RO

11、X0.27.4PE PCR Primer1.10.311.1Index PCR Primer RR0.311.1EX Taq HS0.13.7TemplateTotal9333*标准品5个浓度各2个反应孔，NTC（无模板对照）1个反应孔，每个样品3个反应孔，2孔用于移液损失，共37孔。表3-4-2 SE Mix的配置组分1次反应所需用量（l）53次反应所需用量（l）SE Mix7371dNTP(2.5mM)0.842.4Eva Green0.526.5ROX0.210.6SE PCR Primer1.10.210.6SE PCR Primer2.10.210.6EX Taq HS0.15.3T

12、emplateTotal9477*2条标准曲线，标准品5个浓度各2个反应孔，NTC（无模板对照）1个反应孔，每个样品3个反应孔，2孔用于移液损失，共53孔。其中，PE Mix和SE Mix的组分和每孔反应所需的用量如下表： 表3-4-3 PE Mix 表3-4-4 SE Mix组分所需用量（l）组分所需用量（l）10 Buffer110 Buffer1MgSO40.1MgSO40.1Tween 20 1000.1Tween 20 1000.1DMSO0.5DMSO0.5H2O3.35H2O3.3Betaine2Betaine2Total7.05Total73）上下颠倒离心管混匀或振荡10至15

13、秒，短暂离心。4）将反应预混液置于4 或冰上。【注意】 配制反应预混液必须到“Mix配制区”进行，避免扩增子污染。 移取PE Mix或 SE Mix前，摇晃离心管以彻底混匀。 使用超纯水配制反应预混液。 Mix配制区的所有物料，仪器，工具都严禁带到其他区域。3.5 加样1）Mix配制好之后，将Mix放在传递窗中，回到稀释样品的实验室，将Mix从传递窗中取出，并在“点样区”进行加样。2) 取出96孔国产光学反应板置于基座上。3） 将预先配好地反应预混液加到各反应管孔中，每孔加入9l 反应预混液。然后按照由A到H、由1到12的顺序向反应孔中加入1 l 已稀释的标准品、样品和阴性对照，向标准品反应孔

14、中加入1 l 梯度稀释的标准品，每个梯度重复两次；向样品反应孔中加入1 l 已稀释的样品，每个样品重复三次；向无模板对照（NTC）反应孔中加入1 l 已灭菌超纯水。4）使用ABI公司配备的封膜工具和光学封口膜（泛特津）封闭反应板。5）封好膜之后，到荧光定量PCR仪放置的实验室，使用Labnet 的MPS-1000微孔板离心机离心反应板，离心时间为4min。离心前注意配平。板子放置时，底部朝外。6）将反应板装载到StepOnePlus扩增仪以准备运行。3.6设置反应程序 3.6.1 双击桌面 StepOne software v2.0 软件快捷键。 3.6.2 如果有设置好的程序模板，则点击菜单

15、栏的“Open”在“桌面/Q-PCR Results/Q-PCR Templates”里找到和Q-PCR实验登记表上名字相同的程序模板，在Experiment Name栏中用“检测人姓名拼音+检测日期+程序名称”命名，然后根据标准品和点样的顺序设置好板位，输入标准品名称和样品名称，并将设置好的程序保存在“桌面/Q-PCR Results/Q-PCR Results”中以检测日期命名的文件夹中。 3.6.3如果没有程序模板的，则在 Set Up 列中，单击 Advanced Setup ，如图3-1。图3-1 3.6.3.1 在左侧导航窗格中，单击 Experiment Properties ：

16、1） 单击 Experiment Name ，然后输入实验名称，如图3-2所示。2） 单击 StepOnePlusTM Instrument（96 well）。3） 选择实验方法，单击 Quantitation-Standard Curve。4） 根据实验选择试剂类型，单击选择 TaqMan Reagents 或 SYBR Green Reagents。5） 为升降温速度选择 Standard (2 hours to complete a run) ，若使用Fast试剂系列则选择Fast（40 minutes to complete a run）。图3-2 3.6.3.2 在左侧导航窗格中，单

17、击 Plate Setup ：1） 首先设置define Targets and Samples,如图3-3所示，在左侧Define Targets中单击 Target Name 单元格，然后输入靶名称。2） 从 Reporter 下拉菜单中，选择 FAM 或 SYBR。 3） 从 Quencher 下拉菜单中，如果 Reporter 选择 SYBR， Quencher 则选择 None，如果Reporter选择FAM，则Quencher选择NFQ-MGB。4） 保留 Color 字段中的默认设置。5） 单击 Sample Name 单元格，根据样品个数增加样品数量（可单击 Add New S

18、ample）并输入样品名称。6） 保留 Color 字段中的默认设置。 图3-37） 单击右侧 Assign Targets and Samples，设置反应板布局,如图3-4。8） 在 View Plate Layout 选择反应孔，在 Assign target(s) to the selected wells 单击 Assign 复选框，在 Task 中选择相应的类型（U表示未知样品，S表示标准品，N表示无模板对照），如果选择 S 可在 Quantity 输入相应的标准品浓度。9） 在 View Plate Layout 选择样品反应孔，在 Assign Sample(s) to the

19、 selected wells 单击 Assign 相应样品的复选框。图3-4图3-53.6.3.3 在左侧导航窗格中，单击 Run Method ：1）单击 Graphical View 选项卡（默认）。2）单击 Reaction Volume Per Well ，然后输入相应的每个孔的反应体积。3）单击反应温度或反应时间按需要进行修改，单击延伸阶段反应时间下面的荧光信号采集图标，以确定荧光信号采集的阶段（当图标为灰色时表示未被选中）。3.6.3.4 将设置好的程序保存在“桌面/Q-PCR Results/Q-PCR Results”中以检测日期命名的文件夹中。3.7 运行实验【健康和安全警

20、告】操作期间，样本加热块温度可能超过100 C。 在样本加热块降温至室温之前，请勿触碰扩增仪。1）在 Run Status 点击绿色按钮 START RUN，运行实验。图3-62）实验结束后，取出反应板，用一次性PE手套密封后丢在旁边的垃圾桶内(防止荧光染料污染实验室）。3.8 分析数据 实验结束后,在左侧导航窗格中，单击 Analysis :图3-71）单击 Amplification Plot 查看扩增曲线，如图3-7所示。2）单击 Standard Curve 查看标准曲线的R2值、扩增效率Eff%，如图3-8所示。图3-83）单击右上方 View Well Table 查看Ct值和浓度

21、，如图3-9。 将数据导出到Excel表中，导出方法为：点击File，选择File菜单中的Export，在弹出的对话框中的Export Properties中勾选Results，然后根据需要设置Export File Name和Export File Location。设置完毕，点击Start Export。数据导出结束后，在弹出的对话框中选择Close Export Tool。 查看数据，由于标准品的浓度范围为0.1pM-1nM，为保证数据的可信度，应剔除超出标准曲线范围的样品梯度浓度。样品都已进行稀释，需要按照稀释度换算成原浓度再求平均值。 图3-94数据管理和记录管理本实验要求：1) 在

22、Q-PCR实验登记表上填写相应样品的Q-PCR浓度。2) 在“表单准备区”的计算机桌面上的“文库交接检测”文件夹中的_文库检测结果Excel文件中的相应位置填写：标准品、样品的浓度、检测日期、操作人、鉴定人以及结果（是否合格）。样品合格与否的评判标准：根据上机浓度计算出样品的最低浓度，若样品浓度低于最低浓度则不合格；将定量出来的Q-PCR浓度与2100的摩尔浓度相比，如果比值和以往相同类型的样品的比值相近则合格，相差较大则不合格，需重新定量，并将需重测文库所在行的底色改为灰色；如果是Pooling文库，则将Q-PCR浓度与理论浓度相比，如果比值在偏差30%以内则合格，相反则不合格，需重新定量，

23、并将需重测文库所在行的底色改为灰色。如重测结果合格，则填写好重测的样品浓度、检测日期、操作人、鉴定人以及结果（是否合格），并将文库信息底色改为“无填充颜色”；如果重测结果仍然和第一次检测结果一致，则在“结果（是否合格）”一栏标注“已重测，可上机”，并将文库信息底色改为“无填充颜色”。质量评价/质量控制本实验要求：1) 标准品的和样品的R2值均应在0.995以上，扩增效率Eff%应在80以上.2) 如果是表达谱和Small RNA文库，要求同一样品的三个孔的Ct SD应小于0.5。3) 如果使用的是Eva Green作为染料，要求melting curve没有杂峰。要求2）和3）可在QC sum

24、mary中查看。参考文献1 ABI . Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting Guide for Standard Curve ExperimentsZ.2007-01.2 Meyer, M.,Briggs, A W., Maricic,T,.et al. From micrograms to picograms: quantitative PCR reduces the material demands of high-throughput sequencingJ. Nucleic Acids Res,2008, 36

25、:e5.3 Heid,C.A.,Stevens,J.,Livak,K.J.,et al. Real time quantitative PCRJ. Genome Res, 1996 , 6 : 986 - 994.附录1. PE Mix和SE Mix的组分及其含量 附表1-1 PE Mix 附表1-2 SE Mix组分所需用量（l）组分所需用量（l）10 Buffer110 Buffer1MgSO40.1MgSO40.1Tween 20 1000.1Tween 20 1000.1DMSO0.5DMSO0.5H2O3.35H2O3.3Betaine2Betaine2Total7.05Total7

26、2.反应体系与反应条件1)PE、PE Index文库附表2-1-1 组分1次反应所需用量（l）PE Mix7.05dNTP(2.5mM)0.8Probe0.25ROX0.2PE PCR Primer1.10.3Index PCR Primer RR0.3EX Taq HS0.1Template1Total10附表2-1-250 2 min95 10 sec95 30 sec35 cycles60 30 sec72 45 sec2)DNA 和表观遗传组SE 文库附表2-3-1组分1次反应所需用量（l）SE Mix7dNTP(2.5mM)0.8Eva Green0.5ROX0.2SE PCR Pr

27、imer1.10.2SE PCR Primer2.10.2EX Taq HS0.1Template1Total10附表2-3-295 10 sec95 15 sec35 cycles65 30 sec72 30 secMelt curve stage 3)Small RNA 和表达谱SE文库附表2-4-1组分1次反应所需用量（l）SE Mix7dNTP(2.5mM)0.8Eva Green0.5ROX0.2SRNA PCR Primer1.10.2SRNA PCR Primer2.10.2EX Taq HS0.1Template1Total10附表2-4-295 10 sec95 15 sec

28、35 cycles60 30 sec72 15 secMelt curve stage 附录A 修订记录序号修订日期内容摘要修订人批准人12010年10月27日3.4 配制反应预混液 :表3-4-1 PE Mix的配置表3-4-2 SE Mix的配置表3-4-3 PE Mix表3-4-4 SE Mix附录1、PE Mix和SE Mix的组分及其含量:附表1-1 PE Mix附表1-2 SE Mix 2.反应体系与反应条件1)PE、PE Index文库 附表2-1-1 3)Small RNA 和表达谱SE文库 附表2-4-1将反应体系调整至10l陈敏峰THANKS !致力为企业和个人提供合同协议，策划案计划书，学习课件等等打造全网一站式需求欢迎您的下载，资料仅供参考