qpcr步骤.docx

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qpcr步骤

范围和适用性

本实验适用于使用StepOnePlus™实时PCR仪对DNAPE、DNAPEIndex、SE文库以及ExonCapture组、转录组、表达谱、SmallRNA组、表观遗传组等制备的文库进行上机前的精确定量。

摘要

荧光定量PCR实验是以Agilent2100Bioanalyzer对文库的检测结果为参照,使用StepOnePlus™实时PCR仪对文库进行定量,得出待测文库浓度，为之后的Cluster制备提供浓度依据。

该实验的主要内容包括：

（1）梯度稀释标准品；

（2）按实验要求稀释样品；（3）配制反应预混液；（4）加样；（5）设置反应程序；（6）运行实验；（7）分析实验结果，计算待测样品浓度。

整个流程需要3-4小时。

缩写词和SOP中专业术语的解释

缩写词或术语

解释

基线（Baseline）

扩增曲线中的水平部分

阈值（Threshold）

高于基线但处于扩增曲线的指数增长区范围之内的荧光水平。

Ct值

扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。

实验材料及方法

1实验试剂和耗材

1.1试剂

表1-1实验所需试剂

试剂名称

货号

生产厂家

10×Buffer

DDR006B

TAKARA

dNTP（2.5mM）

DDR006B

TAKARA

EXHSTaq

DDR006B

TAKARA

TaqManPEProbe

上海生工

PEQ-PCRPrimer1.1

上海生工

IndexQ-PCRPrimerRR

上海生工

SEQ-PCRPrimer1.1

上海生工

SEQ-PCRPrimer2.1

上海生工

ROX

12223－012

Invitrogen

含ThermoPol缓冲液MgSO4（100mM）

B9004S

NEB

Tween20

P9416-100ML

SIGMA

DMSO

DT0163-500ML

上海生工

Betaine

B2629-1KG

SIGMA

SRNAPCRPrimer1

上海生工

SRNAPCRPrimer2

上海生工

1.2耗材

表1-2实验所需耗材

耗材

型号

生产厂家

96孔国产光学反应板

国产

光学封口膜（泛特津）

国产

0.2mlSterile,PCRmicrotubes

PCR-02D-C

Axygen

0.6ml离心管

MCT-060-C

Axygen

吸嘴0.5-10ul超微量、袋装

T-300

Axygen

吸嘴200ul黄色吸嘴、袋装

T-200-Y

Axygen

吸嘴1000ul蓝色、袋装

T-1000-Y

Axygen

1.5ml离心管

MCT-150-C

Axygen

2实验仪器设备

表2-1实验所需仪器设备

设备

型号

生产厂家

StepOnePlus™Real-TimePCRSystem

4376592

ABI

迷你离心机

LX-200

海门其林贝尔

Vortex

QL－901

海门其林贝尔

微孔板离心机

MPS-1000

Labnet

3实验操作流程

3.1填写Q-PCR实验登记表

样品的交接按照《质控组样品交接管理规程》执行。

实验前，先在“表单准备区”将要检测的样品在《Q-PCR实验登记表》中填写好，并根据“文库交接检测”文件夹中《____组文库检测结果》中的待测样品的顺序按顺序填到《Q-PCR实验登记表》上，并在右上角注明批次后打印出来。

然后将需要检测的样品的样品名和文库号按照《Q-PCR实验登记表》上的顺序粘贴到“文库核对&存放位置”文件夹中的《文库检测前核对表》Excel表中，等待核对样品信息。

3.2稀释标准品

开始实验前，到-20℃冰箱和冰柜中将实验所需的标准品和样品取出，并按Q-PCR实验登记表上的顺序排好，并到表单准备区，用扫描枪将样品的文库号扫描到“文库核对&存放位置”文件夹中的《文库检测前核对表》Excel表中进行核对，核对结果为“错错错错”，则样品不正确需重新找取样品信息相同的样品；核对结果为“对”，则样品正确。

核对完样品信息后，将样品和标准品拿到“稀释区”进行稀释。

名称

移液量

超纯水（μl）

终浓度（pM）

Std1

原管（1nM）

不稀释

1000

Std2

2μl（Std1）

18

100

Std3

2μl（Std2）

18

10

Std4

2μl（Std3）

18

1

Std5

2μl（Std4）

18

0.1

1）取5个0.2mlPCR离心管，分别标记为Std1、Std2、Std3、Std4和Std5。

标准品多于一种时应标明标准品的名称。

2）分别吸取18μl超纯水至Std2、Std3、Std4和Std5离心管。

3）使用新Tip移取2μlStd1至装有18μl超纯水的Std2离心管，用Vortex振荡10至15秒，用力用手甩离心管，将壁上的液体甩下。

4）使用新Tip移取2μlStd2至装有18μl超纯水的Std3离心管，用Vortex振荡10至15秒，用力用手甩离心管，将壁上的液体甩下。

5）使用新Tip移取2μlStd3至装有18μl超纯水的Std4离心管，用Vortex振荡10至15秒，用力用手甩离心管，将壁上的液体甩下。

6）使用新Tip移取2μlStd4至装有18μl超纯水的Std5离心管，用Vortex振荡10至15秒，用力用手甩离心管，将壁上的液体甩下。

7）将已稀释的标准品置于4℃或冰上。

【注意】

●原管（1nM）的标准品要用时从-20℃冰箱中的标准品盒子中取出；不用时应及时放回-20℃冰箱中，以防降解。

●实验前带上口罩和新手套，并用70%酒精将实验台擦拭一遍。

●移液要准确，振荡要充分，振荡前需检查管盖是否盖严。

●使用超纯水稀释标准品。

3.3稀释样品

1）如果待测文库是需要混合的Index文库，则先按照《Q-PCRpooling规则》混合好，贴好标签等待检测。

2）取和待测样品数量相同的0.6mlPCR离心管，分别标记为待测样品名称或者是样品管盖上的记号。

3）如果待测样品体积小于15ul（如表达谱、SmallRNA组的样品），则分别吸取99μl超纯水至每个离心管中；如果待测样品体积大于15ul，则分别吸取198μl超纯水至每个离心管中。

4）将待测文库的样品原管充分振荡，短暂离心后，按照Q-PCR实验登记表上的顺序排好，然后分别移取样品溶液至相对应的装有超纯水的离心管中，如果样品体积小于15ul的，则吸取1ul的样品到装有99ul超纯水的离心管中；如果样品体积大于15ul，则吸取2ul样品到装有198ul超纯水的离心管中。

振荡10至15秒，短暂离心。

5）将已稀释的样品置于4℃或冰上；将样品原管放回-20℃冰柜中的编号盒存放，将样品放到编号盒中腾空的位置，并将样品的文库号用扫描枪录入“文库核对&存放位置”文件夹中的《上机文库存放位置表》Excel表中的对应位置存档。

【注意】

●移液要准确，振荡要充分，振荡前需检查管盖是否盖严，吸取样品后确保管盖盖严。

●使用的超纯水稀释样品。

3.4配制反应预混液

1）到隔壁实验室的“Mix配制区”配制反应预混液。

取1.5ml或2ml离心管，在管盖上标记上Mix，套上锡箔纸。

2）按以下反应体系准备反应预混液（以8个PE样品、1条标准曲线和10个SE样品、2条标准曲线为例）：

表3-4-1PEMix的配置

组分

1次反应所需用量（μl）

37次反应所需用量（μl）

PEMix

7.05

260.85

dNTP（2.5mM）

0.8

29.6

Probe

0.25

9.25

ROX

0.2

7.4

PEPCRPrimer1.1

0.3

11.1

IndexPCRPrimerRR

0.3

11.1

EXTaqHS

0.1

3.7

Template

——

——

Total

9

333

*标准品5个浓度各2个反应孔，NTC（无模板对照）1个反应孔，每个样品3个反应孔，2孔用于移液损失，共37孔。

表3-4-2SEMix的配置

组分

1次反应所需用量（μl）

53次反应所需用量（μl）

SEMix

7

371

dNTP（2.5mM）

0.8

42.4

EvaGreen

0.5

26.5

ROX

0.2

10.6

SEPCRPrimer1.1

0.2

10.6

SEPCRPrimer2.1

0.2

10.6

EXTaqHS

0.1

5.3

Template

——

——

Total

9

477

*2条标准曲线，标准品5个浓度各2个反应孔，NTC（无模板对照）1个反应孔，每个样品3个反应孔，2孔用于移液损失，共53孔。

其中，PEMix和SEMix的组分和每孔反应所需的用量如下表：

表3-4-3PEMix表3-4-4SEMix

组分

所需用量（μl）

组分

所需用量（μl）

10×Buffer

1

10×Buffer

1

MgSO4

0.1

MgSO4

0.1

Tween20100×

0.1

Tween20100×

0.1

DMSO

0.5

DMSO

0.5

H2O

3.35

H2O

3.3

Betaine

2

Betaine

2

Total

7.05

Total

7

3）上下颠倒离心管混匀或振荡10至15秒，短暂离心。

4）将反应预混液置于4℃或冰上。

【注意】

●配制反应预混液必须到“Mix配制区”进行，避免扩增子污染。

●移取PEMix或SEMix前，摇晃离心管以彻底混匀。

●使用超纯水配制反应预混液。

●Mix配制区的所有物料，仪器，工具都严禁带到其他区域。

3.5加样

1）Mix配制好之后，将Mix放在传递窗中，回到稀释样品的实验室，将Mix从传递窗中取出，并在“点样区”进行加样。

2）取出96孔国产光学反应板置于基座上。

3）将预先配好地反应预混液加到各反应管孔中，每孔加入9μl反应预混液。

然后按照由A到H、由1到12的顺序向反应孔中加入1μl已稀释的标准品、样品和阴性对照，向标准品反应孔中加入1μl梯度稀释的标准品，每个梯度重复两次；向样品反应孔中加入1μl已稀释的样品，每个样品重复三次；向无模板对照（NTC）反应孔中加入1μl已灭菌超纯水。

4）使用ABI公司配备的封膜工具和光学封口膜（泛特津）封闭反应板。

5）封好膜之后，到荧光定量PCR仪放置的实验室，使用Labnet的MPS-1000微孔板离心机离心反应板，离心时间为4min。

离心前注意配平。

板子放置时，底部朝外。

6）将反应板装载到StepOnePlus扩增仪以准备运行。

3.6设置反应程序

3.6.1双击桌面StepOnesoftwarev2.0软件快捷键。

3.6.2如果有设置好的程序模板，则点击菜单栏的“Open”在“桌面/Q-PCRResults/Q-PCRTemplates”里找到和《Q-PCR实验登记表》上名字相同的程序模板，在ExperimentName栏中用“检测人姓名拼音+检测日期+程序名称”命名，然后根据标准品和点样的顺序设置好板位，输入标准品名称和样品名称，并将设置好的程序保存在“桌面/Q-PCRResults/Q-PCRResults”中以检测日期命名的文件夹中。

3.6.3如果没有程序模板的，则在SetUp列中，单击AdvancedSetup，如图3-1。

图3-1

3.6.3.1在左侧导航窗格中，单击ExperimentProperties：

1）单击ExperimentName，然后输入实验名称，如图3-2所示。

2）单击StepOnePlusTMInstrument（96well）。

3）选择实验方法，单击Quantitation-StandardCurve。

4）根据实验选择试剂类型，单击选择TaqManReagents或SYBRGreenReagents。

5）为升降温速度选择Standard（～2hourstocompletearun），若使用Fast试剂系列则选择Fast（～40minutestocompletearun）。

图3-2

3.6.3.2在左侧导航窗格中，单击PlateSetup：

1）首先设置defineTargetsandSamples,如图3-3所示，在左侧DefineTargets中单击TargetName单元格，然后输入靶名称。

2）从Reporter下拉菜单中，选择FAM或SYBR。

3）从Quencher下拉菜单中，如果Reporter选择SYBR，Quencher则选择None，如果Reporter选择FAM，则Quencher选择NFQ-MGB。

4）保留Color字段中的默认设置。

5）单击SampleName单元格，根据样品个数增加样品数量（可单击AddNewSample）并输入样品名称。

6）保留Color字段中的默认设置。

图3-3

7）单击右侧AssignTargetsandSamples，设置反应板布局,如图3-4。

8）在ViewPlateLayout选择反应孔，在Assigntarget（s）totheselectedwells单击Assign复选框，在Task中选择相应的类型（U表示未知样品，S表示标准品，N表示无模板对照），如果选择S可在Quantity输入相应的标准品浓度。

9）在ViewPlateLayout选择样品反应孔，在AssignSample（s）totheselectedwells单击Assign相应样品的复选框。

图3-4

图3-5

3.6.3.3在左侧导航窗格中，单击RunMethod：

1）单击GraphicalView选项卡（默认）。

2）单击ReactionVolumePerWell，然后输入相应的每个孔的反应体积。

3）单击反应温度或反应时间按需要进行修改，单击延伸阶段反应时间下面的荧光信号采集图标，以确定荧光信号采集的阶段（当图标为灰色时表示未被选中）。

3.6.3.4将设置好的程序保存在“桌面/Q-PCRResults/Q-PCRResults”中以检测日期命名的文件夹中。

3.7运行实验

【健康和安全警告】

操作期间，样本加热块温度可能超过100°C。

在样本加热块降温至室温之前，请勿触碰扩增仪。

1）在RunStatus点击绿色按钮STARTRUN，运行实验。

图3-6

2）实验结束后，取出反应板，用一次性PE手套密封后丢在旁边的垃圾桶内（防止荧光染料污染实验室）。

3.8分析数据

实验结束后,在左侧导航窗格中，单击Analysis:

图3-7

1）单击AmplificationPlot查看扩增曲线，如图3-7所示。

2）单击StandardCurve查看标准曲线的R2值、扩增效率Eff%，如图3-8所示。

图3-8

3）单击右上方ViewWellTable查看Ct值和浓度，如图3-9。

将数据导出到Excel表中，导出方法为：

点击File，选择File菜单中的Export，在弹出的对话框中的ExportProperties中勾选Results，然后根据需要设置ExportFileName和ExportFileLocation。

设置完毕，点击StartExport。

数据导出结束后，在弹出的对话框中选择CloseExportTool。

查看数据，由于标准品的浓度范围为0.1pM-1nM，为保证数据的可信度，应剔除超出标准曲线范围的样品梯度浓度。

样品都已进行稀释，需要按照稀释度换算成原浓度再求平均值。

图3-9

4数据管理和记录管理

本实验要求：

1）在Q-PCR实验登记表上填写相应样品的Q-PCR浓度。

2）在“表单准备区”的计算机桌面上的“文库交接检测”文件夹中的《____文库检测结果》Excel文件中的相应位置填写：

标准品、样品的浓度、检测日期、操作人、鉴定人以及结果（是否合格）。

样品合格与否的评判标准：

①根据上机浓度计算出样品的最低浓度，若样品浓度低于最低浓度则不合格；②将定量出来的Q-PCR浓度与2100的摩尔浓度相比，如果比值和以往相同类型的样品的比值相近则合格，相差较大则不合格，需重新定量，并将需重测文库所在行的底色改为灰色；③如果是Pooling文库，则将Q-PCR浓度与理论浓度相比，如果比值在偏差30%以内则合格，相反则不合格，需重新定量，并将需重测文库所在行的底色改为灰色。

④如重测结果合格，则填写好重测的样品浓度、检测日期、操作人、鉴定人以及结果（是否合格），并将文库信息底色改为“无填充颜色”；如果重测结果仍然和第一次检测结果一致，则在“结果（是否合格）”一栏标注“已重测，可上机”，并将文库信息底色改为“无填充颜色”。

质量评价/质量控制

本实验要求：

1）标准品的和样品的R2值均应在0.995以上，扩增效率Eff%应在80以上.

2）如果是表达谱和SmallRNA文库，要求同一样品的三个孔的CtSD应小于0.5。

3）如果使用的是EvaGreen作为染料，要求meltingcurve没有杂峰。

要求2）和3）可在QCsummary中查看。

参考文献

[1]ABI.AppliedBiosystemsStepOne™Real-TimePCRSystemGettingGuideforStandardCurveExperiments[Z].2007-01.

[2]Meyer,M.,Briggs,AW.,Maricic,T,.etal.Frommicrogramstopicograms:

quantitativePCRreducesthematerialdemandsofhigh-throughputsequencing[J].NucleicAcidsRes,2008,36:

e5.

[3]Heid,C.A.,Stevens,J.,Livak,K.J.,etal.RealtimequantitativePCR[J].GenomeRes,1996,6:

986-994.

附录

1.PEMix和SEMix的组分及其含量

附表1-1PEMix附表1-2SEMix

组分

所需用量（μl）

组分

所需用量（μl）

10×Buffer

1

10×Buffer

1

MgSO4

0.1

MgSO4

0.1

Tween20100×

0.1

Tween20100×

0.1

DMSO

0.5

DMSO

0.5

H2O

3.35

H2O

3.3

Betaine

2

Betaine

2

Total

7.05

Total

7

2.反应体系与反应条件

1）PE、PEIndex文库

附表2-1-1

组分

1次反应所需用量（μl）

PEMix

7.05

dNTP（2.5mM）

0.8

Probe

0.25

ROX

0.2

PEPCRPrimer1.1

0.3

IndexPCRPrimerRR

0.3

EXTaqHS

0.1

Template

1

Total

10

附表2-1-2

50℃

2min

95℃

10sec

95℃

30sec

35cycles

60℃

30sec

72℃

45sec

2）DNA和表观遗传组SE文库

附表2-3-1

组分

1次反应所需用量（μl）

SEMix

7

dNTP（2.5mM）

0.8

EvaGreen

0.5

ROX

0.2

SEPCRPrimer1.1

0.2

SEPCRPrimer2.1

0.2

EXTaqHS

0.1

Template

1

Total

10

附表2-3-2

95℃

10sec

95℃

15sec

35cycles

65℃

30sec

72℃

30sec

Meltcurvestage

3）SmallRNA和表达谱SE文库

附表2-4-1

组分

1次反应所需用量（μl）

SEMix

7

dNTP（2.5mM）

0.8

EvaGreen

0.5

ROX

0.2

SRNAPCRPrimer1.1

0.2

SRNAPCRPrimer2.1

0.2

EXTaqHS

0.1

Template

1

Total

10

附表2-4-2

95℃

10sec

95℃

15sec

35cycles

60℃

30sec

72℃

15sec

Meltcurvestage

附录A修订记录

序号

修订日期

内容摘要

修订人

批准人

1

2010年10月27日

3.4配制反应预混液:

表3-4-1PEMix的配置

表3-4-2SEMix的配置

表3-4-3PEMix

表3-4-4SEMix

附录

1、PEMix和SEMix的组分及其含量:

附表1-1PEMix

附表1-2SEMix

2.反应体系与反应条件

1）PE、PEIndex文库附表2-1-1

3）SmallRNA和表达谱SE文库附表2-4-1

将反应体系调整至10μl

陈敏峰

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