第二章精液斑检验Seminal stain inspection.docx

1、第二章精液斑检验Seminal stain inspection第二章 精液斑检验(Chapter 2 Seminal stain inspection)第一节 精液斑检验概述精液斑(seminal stain) 是法医常见物证检材，在强奸、猥亵等案件中往往涉及精液斑检验。(Semen spots is a common forensic evidence samples , in cases of rape , indecent assault and other cases often involve semen spot test.)一、精液与精液斑的特点 (The characteri

2、stics of semen and seminal stain)(一)精液的特点 (The characteristics of semen)精液主要由精子(spermatozoa)及精浆(seminal plasma)组成，是一种含蛋白质、各种酶及果糖等多种成分的碱性乳白色胶状液体。(Seminal mainly consist of spermatozoa and seminal plasma, a alkalinity contain protein, a variety of enzymes and fructose milky colloidal liquid.)除精子外，还有睾丸

3、细胞、白细胞、脱落柱状上皮细胞、前列腺卵磷脂小体、玻璃小体、各种形状的精胺结晶、色素颗粒、脂肪球等。正常精液白细胞数每高倍镜视野少于5个。精浆是由男性各附属性腺分泌物所组成，其中精囊液约占 50%80%、前列腺液占15%30%、尿道球腺液、尿道旁腺液约占 5%。精囊液呈碱性，含有两种主要成分：果糖和凝固酶。前列腺液呈透明的酸性液体，含有高浓度的酸性磷酸酶、纤溶酶和中性蛋白酶。(Prostate fluid is transparent acid liquid, contains high concentrations of acid phosphatase.)尿道球腺和旁腺液是一种呈浅灰白色的

4、液体。精液含蛋白浓度约为 35-55mg/ml，略低于血清蛋白平均浓度(72mg/ml)。精液中蛋白可分为两类：一类是与人血清共有的蛋白成分，如白蛋白、1-酸性糖蛋白、型特异性成分、转铁蛋白、IgA、IgG、1-糖蛋白、纤维蛋白原、胰岛素等。另一类是精浆中特有的蛋白成分，如前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，p30)、-微精蛋白(-microseminoprotein，-MSP)、-精浆蛋白 (-seminnoprotein,-sm)以及2-精浆糖蛋白(2-seminoglyco protein， 2-SGP)等。精液中含有多种酶类，某些酶的活性水平很高，如酸

5、性磷酸酶、磷酸葡糖变位酶、-谷氨酰转肽酶、乳酸脱氢酶、黄递酶、乙二醛酶、酯酶、碱性磷酸酶、纤溶酶、透明质酸酶、淀粉酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶以及凝固酶等。 精液还含有精胺(561418g/ml)、胆碱、前列腺素、除能因子、蛋白酶抑制因子等。精胺被精液中的二胺氧化酶氧化，即产生精液的特殊气味。 精液为乳白色半透明的粘稠液体，长期未排精时可稍呈黄色。有特殊的麝香或樱粟花气味，呈弱碱性 pH7.28.6，平均 7.8，比重 1.0211.040，渗透压2 0.550.58。射精后的体外精液接触空气，由于受精囊腺分泌的凝固酶的作用，约 5min 内凝结成胶冻状。继而在中性蛋白酶及纤溶酶作用下，约 203

6、0min内液化成稀薄半流动体状。 （二）精子形态特点 (The characteristics of semen morpha)正常精子分头、 尾两部分， 长约60m， 外形似蝌蚪，头部长3 5m，宽 23m，厚 12m，正面观呈卵圆形，侧面观呈梨形，主要由顶体 （acrosome） 和致密的精子细胞核组成。(Normal sperm separate into head and tail two parts, about 60m, shape like tadpoles, the head of it is about 3 5m longth, 23m width, 12m thicknes

7、s, oval front view , side view was pear-shaped , mainly consisted of acrosome and dense composition of the sperm nucleus.)空泡状顶体覆盖了精子细胞核的前2/3，内含多种水解酶，如顶体蛋白酶、透明质酸酶、酸性磷酸酶等，在受精时有利于精子穿透卵子外周的放射冠与透明带而进入卵内。精子细胞核除含有染色质外，还含有各种大小的空泡。尾部长达4060m，细长而弯曲。分为颈段、中段、主段和末段四部分。受精时，仅头部进入卵细胞，即使有少量线粒体鞘内的mtDNA也进入卵子，其与卵子所含的上万数

8、目的mtDNA相比，几乎对基因型不产生影响，故 mtDNA呈母系遗传。 （三）精液斑的特点 (The characteristics of seminal stain)1.定义：精液斑是精液浸润或附着于基质上，干燥后形成的斑痕。(The semen dried outside the body called seminal stain.)2.精斑存在的位置(The position that seminal may exist)：精斑多附着于犯罪嫌疑人或被害人的衣、裤上，女性的外阴部或大腿内侧，现场的被褥、毛巾、纸张、草席、床板、沙石、泥土等。此外，阴道擦拭物(Vaginal swabs)也是

9、常见的精斑检材。(The seminal stain may exist in suspect or victim, sometime in the case scene, especially in the vaginal swabs.)精斑无固定的形态，外观常因附着物不同而有差异,新鲜精斑有特殊腥气味(Sperm has no fixed shape, appearance often differ due to the attachments , fresh semen stains with special fishy odor.)： （1）在体表，精斑常呈白色鳞片状痂片(White

10、scaly crust slice)。（2）在深色纺织品(Dark textiles)上，浓厚精斑呈灰白色浆糊状斑迹(Thick semen stain is pasty pale)，偶可见结痂(sometimes scab)；较稀薄的精斑浸润于布纤维间，则不易察见。（3）在浅色纺织品上，精斑多呈黄白色地图状，边缘色深。用放大镜检查，可在布纤维表面或中间见黄白色小鳞片。（4）在软质载体，如衣、裤、纸张上的精斑手触之有硬感。 二、精斑检验的目的与要求 (The purposes and requirements of bloodstain inspection.)1.精斑检验的主要目的：为案件的

11、侦查提供线索，为分析、审理案件提供证据。(The main purpose of seminal inspection: Provide clues for the investigation of cases, provide evidence for analyse and judge the cases.)2.对疑为精斑的检材需要解决下列问题(The inspection of suspected seminal stain should solve the following problems)：可疑斑痕是否为精斑？若是精斑，确定精斑的个体来源。3.检验步骤为：肉眼观察(Visual

12、Inspection)、预试验 (Trial Test)、确证试验(Confirmatory Test)、种属鉴定(Species Identification)，遗传标记测定(Determination of genetic markers)。三、精斑的肉眼检验(The visual inspection of seminal stain)肉眼检查的目的：是发现可疑精斑，确定所在部位及分布，以便准确取材检验，提高阳性率。有时可根据精斑的形态、部位分析有关作案过程。(To increase the positive rate of the text, have the visual inspe

13、ction to ensure the distribution of the suspicious semen stains.) （1）典型的精斑：呈不规则地图状。观察并记录斑迹的分布情况、数目、位置、形状、大小、颜色及光泽等。新鲜精斑触之有干浆糊斑状的硬感，有特殊的腥味。 （2）水洗、雨淋后的，或有色基质上的精斑肉眼比较难观察。可将检材置于紫外光下于暗处观察。紫外线检查：精斑中含有黄素(flavin)，在紫外线照射下显银白色荧光，斑痕边缘呈浅紫蓝色。水洗过、肉眼不能发现的精斑，在紫外线下仍发浅淡的点片状荧光。(Semen stains show silver fluorescence un

14、der the ultraviolet light with the pale violet blue flecked edge because of the flavin.)注意：阴道分泌物、尿液、鼻涕、唾液、乳汁、脓液、肥皂斑、洗涤剂、植物汁液、纺织品中的某些色素、染料、漂白剂、含荧光素的各种载体等在紫外线下也能发与精斑类似的荧光 ，故紫外线检查阳性结果仅表示斑痕可能是精斑。精斑过于淡薄，数天或者数年的精斑，可无荧光，故阴性结果不能轻易否定精斑。优势：紫外线检查方法简便，不损害检材，不影响检材作其他项目的检验。一般在肉眼不易辨别时作精斑定位用。 四、精斑的预试验 (The Trial Te

15、st of seminal stain)预试验的目的：是筛选可疑精斑，故要求方法简单，灵敏度高。(The purpose of the trial test is screening suspicious sperm, thus to require the method can be easy operate and high sensitivity.)精斑预试验方法很多，常用的方法如下： 一、酸性磷酸酶检验 (Acid phosphatase test)精液的主要成分前列腺分泌液中含有大量酸性磷酸酶(acid phosphatase， ACP)，浓度为5404000u/ml，较其他体液、分

16、泌液及脏器的含量高100倍以上。除精液外，部分蔬菜、水果也含少量酸性磷酸酶。此外，某些避孕药ACP检测也呈弱阳性反应。 故该试验只能作为精斑的预试验。 由于酸性磷酸酶来源于前列腺，无精子的精液ACP试验也呈阳性结果。 精斑中酸性磷酸酶相当稳定，对腐败及高热有较强的抵抗力。保存10余年的陈旧精斑，夏日室温放置8周的腐败精液及125加热30min的精液仍能检出其酶活性，但200加热5min则破坏ACP酶活性。 常用磷酸苯二钠显色试验检测酸性磷酸酶。 （一）磷酸苯二钠试验 (Kind-King试法) 1原理：精液中的酸性磷酸酶可分解磷酸苯二钠，产生萘酚，后者经铁氰化钾作用并与氨基安替比林结合，生成红

17、色醌类化合物。 2试剂：由反应缓冲液和显色液两部分组成。 缓冲液：磷酸苯二钠 0.2g，4-氨基安替比林 0.6g，柠檬酸 1.4g，1mol/L 氢氧化钠 12.5ml ，蒸馏水加至 100ml，加热溶解后置冷水中迅速冷却，加 0.5ml 氯仿。 显色液：铁氰化钾 3.6g，1mol/L 氢氧化钠 16.7ml，碳酸氢钠 1.4g，蒸馏水加至100ml。 3方法： 取可疑斑痕0.1cm0.1cm，最好取斑痕边缘部位，置试管内，加缓冲液34滴，经37温箱内5-10min后，加等量显色液，立即出现红色为阳性反应，表明检材可能是精斑。颜色深浅与酸性磷酸酶浓度呈正比，浓度愈高，颜色愈深红，浓度过高可

18、出现红色沉淀。呈橙黄色为阴性反应，表明检材不是精斑或精斑中的酸性磷酸酶被破坏。 同时剪取无斑痕处检材及己知精斑作阴性与阳性对照。 4.评价：（1）磷酸苯二钠试验灵敏度较高，稀释20 000 倍的精液仍呈阳性反应。被水洗过的淡薄精斑，只要适当延长缓冲液浸泡时间可呈阳性结果。精液如混有血液并不影响检验，血痕在该试验中呈灰褐色。由于该试验灵敏度很高，所以操作时，一般按空白部位、可疑精斑、己知精斑的顺序剪取检材，避免污染。(High sensitivity)（2）酸性磷酸酶试验的特异性较差，1g内脏组织如肺、肝、肾、心、胃等，用5ml缓冲液浸泡的浸液以及常见的人体分泌物或者排泄物如鼻涕、汗、唾液、成年

19、男性尿液等也可呈弱阳性反应。为了排除上述假阳性反应，可在显色后将液体稀释 64 倍或将试管再放入 56温箱中 1020min，此时精斑仍维持红色，引起假阳性的红色消褪。(Poor specificity)（3）所有的预试验中除酸性磷酸酶检验外，其他各项试验灵敏度均不高，因此精斑检验和血痕检验不同。实际上精斑不一定要经过预试验后才进行确证试验，可剪取肉眼可见的斑痕直接进行确证试验。 有时预试验阴性的检材还是要进行确证试验，偶有磷酸苯二钠试验阴性，而查见精子的报道。 五、精斑的确证试验 The Confirmatory Test of seminal stain精斑确证试验的目的：检验精液中的特有

20、成分，阳性结果可以确证精斑。(The purpose of seminal stain confirmatory test: Examine the unique ingredients in semen, the positive results can confirm the seminal stain.)精斑确证试验方法很多，主要有以下两类方法：精子检出法(Sperm detection method)和免疫学方法(Immunological methods)。一、精子检出法(Sperm detection method)检出精子是认定精斑最简便、最可靠的方法，不需要特殊试剂和仪器。精子

21、具有典型而稳定的形态，不易受其他因素影响而改变。在显微镜下观察到典型精子，即能确证人精斑。(The find of sperm is the most convenient and reliable method to confirm the seminal stain.)精斑中的精子形态相当稳定，十余年的陈旧精斑也可能查见精子。镜下观察精子是无色的，一般情况下精子头部有折光，尾部很细。检材浸泡后涂片观察，常见精子头部和尾分离。只要检见典型的精子头，也可以确证精斑。(It could confirm the existence of semen stain when a typical spe

22、rm observed under the microscope.)在实际的精斑检验中，常选择合适的浸液及适当的染色方法，以提高精子的检出率。 检材处理 取可疑精斑检材1.5cm1.5cm， 剪碎， 置试管内， 加约0.5ml生理盐水，室温2h，可用玻棒搅拌和压挤检材。然后置4过夜，吸出全部浸液置另一试管内，2 500r/min 离心 5min，上清液留作抗人精液沉淀反应和中和试验。沉淀物涂片，干燥后甲醇固定5min，染色，检验精子。过于陈旧的精斑， 盐水浸渍不易分离精子， 可用5%10%氨液浸渍， 或用0.8% 盐酸、醋酸、胰蛋白酶等浸渍，1224h后弃载体纤维，离心。沉淀经洗涤后涂片、染色

23、、镜检。 染色方法 精子染色方法有单染法和复染法两种。 （1）单染法使用的染料有藻红、亚甲蓝、苏木素等，其中以藻红染色效果较好。 单染法操作简单，但精子和基质都染成同一颜色，不容易观察。藻红染色法：取藻红0.5g，溶于25%氨水100ml配制成藻红染色液。在涂片上滴加 12 滴染色液，室温下染色 35min，水淋洗，干燥后二甲苯透明，高倍镜检查。精子头部和尾部均染呈红色。亚甲蓝染色法 (Loffler法)：亚甲蓝0.3g，加95%乙醇30ml，0.01mol/L KOH 70ml，配制成亚甲蓝染色液。于涂片上滴加12滴染色液，染色1min，水洗，二甲苯透明，盖上盖玻片镜检。精子头后部染呈深蓝色

24、，头前部、尾部不着色或浅染。 （2）复染法复染法使用2种或2种以上染料，所以精子头部、尾部和基质染成不同的颜色，便于观察和分辨。有HE 染色法、酸性品红亚甲蓝染色法。其中以酸性品红亚甲蓝染色法常用。 苏木素伊红(HE) 染色法染色试剂有三种：A. 苏木素染液，称取苏木素0.5g，用无水乙醇5ml溶解。取明矾10g，在蒸馏水中加热溶解， 加入苏木素乙醇液， 加热至溶液呈深紫色， 加入氧化汞0.25g， 迅速冷却。B. 0.5% 伊红染液。C. 1%盐酸酒精溶液，取盐酸1ml，加70%酒精至100ml。染色方法：在涂片上滴加 12 滴苏木素染液，染色 1030min。水淋洗后，加 1%盐酸酒精 5

25、10s，水洗或在水中浸泡 30min 后，加伊红染液 3min，水淋洗。干燥后二甲苯透明，镜检。精子头前半部不着色或浅染，后半部染呈蓝色，尾部染呈红色。 酸性品红亚甲蓝 (Baecchi) 染色法染色液：由1%酸性品红液1ml，1%亚甲蓝8 1ml，1%盐酸 40ml 组成。染色方法：于涂片上滴加染色液，静置 5min，用1%盐酸漂洗，干燥后二甲苯透明，镜检。精子头部呈红色，尾部蓝色。本法仅精子染色显著，其他杂质染色浅淡，有利于精子的检出。显微镜下检见精子需要一定的经验，精斑陈旧、取材部位不准或遇到少精子症者，涂片上往往仅见少量精子，故染色后须仔细地观察，只要找到一个完整的典型精子，即能确证人

26、精斑。精斑在浸渍处理过程中，精子尾部断落，常只检见精子头部，应与阴道滴虫、酵母菌等鉴别。典型的精子头部呈椭圆形，着色特殊，其它植物细胞、细菌、阴道滴虫等则多呈圆形，染色均匀一致。若发现几个典型的精子头部也可确证为精斑。 3.精子的检出时间 性交后精子可以存活一段时间，一般情况下阴道(vagina)内38h，宫颈(cervix)25天，子宫(uterus)、输卵管(oviduct)内 110 天的拭子内容物涂片可检见活精子。阴道内 39 天，宫颈 17 天的内容物涂片可检见死精子。精子的检出期限与被害人的体位、活动情况以及月经周期有关。被害人处于月经期前后或被强奸后就行走，精子检出期限短。在性犯

27、罪调查中， 取阴道拭子的时间越早越好， 如果在24h后取材阴道拭子，精子检测阳性率下降 50%，48h 取材，阳性率仅 10%。活体阴道拭子，精子检出期限一般 1.52 天。若被害人死亡，尸体处于仰卧位，则检出期限较长，阴道拭子中精子不仅数目多、而且形态基本完整，最长的检出期限可达3周。而冰冻 2个半月的尸体，宫颈涂片偶能检出精子。精子检出率也与阴道拭子提取方法与部位有关，例如宫颈刮片和阴道后穹窿部擦拭物精子的检出率较高。 二、免疫学试验 (Immunological methods)制备各种抗人精液特殊成分的抗血清，用免疫学试验，如沉淀反应、酶联免疫吸附试验、胶体金标记试验等检测相应抗原，可

28、以确证精斑。该试验灵敏度高，还可以确证输精管结扎术者和精子缺乏症患者的精斑。常用的有抗人精液血清和抗-p30血清进行的反应。 1.胶体金法 胶体金法是一种免疫层析技术，用胶体金 p30 抗原检测试剂条，又称PSA (prostate specific antigen)试剂条进行精斑确证试验，特异性好，灵敏度高，稀释 6000 倍的精液仍可获阳性结果。另外，试验操作简单，整个试验过程可在 5min 内完成，是目前一项常规技术。(Ignore the disturb of azoospermia, ligation, vaginal fluid or saliva, anti-p30 could

29、pick out human semen stain correctly.)（1）原理及方法精斑确证试验胶体金标记的是鼠抗人p30单克隆抗体，检测线包被有另一种鼠抗人p30单克隆抗体，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。 精斑确证试验在实际工作中可联合使用，如精子检查及抗人精液血清环状沉淀试验均得阳性结果， 可以认定精斑， 如果二者均为阴性结果，可以否定精斑。 六、精斑的个人识别 (The individual identification of seminal stain)精斑检验的主要目的：是进行个人识别，确定现场精斑是谁所遗留。目前精斑个人识别的方法己取得了很大的进展。精斑检验传统的遗传标记主

30、要有 ABO 血型、酶型、血清型等，但是DNA多态性的应用发展很快，应用价值最大。 （一）精斑的ABO血型测定 (The inspection of seminal stain ABO type)ABH血型物质以水溶性形式存在于人的体液、分泌液中，属糖蛋白。分泌型人精液中ABH血型物质与唾液中含量相似，常用中和试验检测；非分泌型精液由于ABH血型物质含量少，需用灵敏的ELISA法检测。 1、中和试验 (Neutralization Test)中和试验是一种检测可溶性血型物质的传统方法。【试验原理】红细胞凝集抑制试验(Hemagglutination inhibition test)。精斑检材中

31、可溶性血型抗原与相应的抗体结合，使抗体的效价下降或消失，凝集红细胞的能力下降或消失。用已知型别指示红细胞检测中和后的抗体效价，凝集能力下降或消失，红细胞不凝集为试验阳性，说明精斑检材具有相应的血型抗原。【结果说明】精斑中ABH物质量必需与相应抗血清中所含的抗体量相当，才能完全中和抗体，获得准确的结果。因此传统的中和法是一种半定量检测，需要将精斑浸液作一系列的稀释度，各稀释液含有不同量的ABH 抗原，能充分中和标化抗血清中的抗体，再加指示红细胞。精斑检材分别与抗-A、抗-B 抗体及抗-H 试剂作中和试验，综合三者反应结果，判定分泌型精斑的ABO血型及分泌能力的强弱。 【方法】 抗血清效价标定 取

32、 12 凹白瓷板一块，以 2 滴抗血清加 2 滴生理盐水作2-4倍数系列稀释，直至1/2048。笫12凹为空白盐水对照。向每凹加入1滴2%指示红细胞悬液，摇匀，室温置30min，观察结果。能使红细胞凝集的抗体最高稀释倍数即为该抗血清的效价。若抗血清的效价为128时，要将之标化为2，应该稀释64倍。 中和试验 取精斑0.5cm 2 ，剪碎置小试管内，加0.5ml生理盐水，搅拌后室温下2h，4冰箱中过夜。取精斑浸出液，在白瓷板内分三列用生理盐水作倍量稀释，稀释度由1/2至1/128。于三列稀释液中分别加入等体积的效价为1：2的抗-A、抗-B抗体及抗-H试剂，摇匀，室温下中和30min。再向三列各凹加入2%指示红细胞悬液各1滴，摇匀后静置30min，观察红细胞凝集情况。以己知ABO血型的分泌型人唾液作阳性对照，以检材无斑痕部分作阴性对照。在己知对照正确的情况下，精斑检材与无精斑检材的抑制凝集相差3级以上，证明精斑中含有相应的血型物质