第二章精液斑检验Seminal stain inspection.docx

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第二章精液斑检验Seminalstaininspection

第二章精液斑检验

（Chapter2Seminalstaininspection）

第一节精液斑检验概述

精液斑（seminalstain）是法医常见物证检材，在强奸、猥亵等案件中往往涉及精液斑检验。

（Semenspotsisacommonforensicevidencesamples,incasesofrape,indecentassaultandothercasesofteninvolvesemenspottest.）

一、精液与精液斑的特点（Thecharacteristicsofsemenandseminalstain）

（一）精液的特点（Thecharacteristicsofsemen）

精液主要由精子（spermatozoa）及精浆（seminalplasma）组成，是一种含蛋白质、各种酶及果糖等多种成分的碱性乳白色胶状液体。

（Seminalmainlyconsistofspermatozoaandseminalplasma,aalkalinitycontainprotein,avarietyofenzymesandfructosemilkycolloidalliquid.）除精子外，还有睾丸细胞、白细胞、脱落柱状上皮细胞、前列腺卵磷脂小体、玻璃小体、各种形状的精胺结晶、色素颗粒、脂肪球等。

正常精液白细胞数每高倍镜视野少于5个。

精浆是由男性各附属性腺分泌物所组成，其中精囊液约占50%～80%、前列腺液占15%～30%、尿道球腺液、尿道旁腺液约占5%。

精囊液呈碱性，含有两种主要成分：

果糖和凝固酶。

前列腺液呈透明的酸性液体，含有高浓度的酸性磷酸酶、纤溶酶和中性蛋白酶。

（Prostatefluidistransparentacidliquid,containshighconcentrationsofacidphosphatase.）尿道球腺和旁腺液是一种呈浅灰白色的液体。

精液含蛋白浓度约为35-55mg/ml，略低于血清蛋白平均浓度（72mg/ml）。

精液中蛋白可分为两类：

一类是与人血清共有的蛋白成分，如白蛋白、α1-酸性糖蛋白、型特异性成分、转铁蛋白、IgA、IgG、α1-糖蛋白、纤维蛋白原、胰岛素等。

另一类是精浆中特有的蛋白成分，如前列腺特异性抗原（prostatespecificantigen，p30）、β-微精蛋白（β-microseminoprotein，β-MSP）、β-精浆蛋白（β-seminnoprotein,β-sm）以及α2-精浆糖蛋白（α2-seminoglycoprotein，α2-SGP）等。

精液中含有多种酶类，某些酶的活性水平很高，如酸性磷酸酶、磷酸葡糖变位酶、γ-谷氨酰转肽酶、乳酸脱氢酶、黄递酶、乙二醛酶、酯酶、碱性磷酸酶、纤溶酶、透明质酸酶、淀粉酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶以及凝固酶等。

精液还含有精胺（56～1418μg/ml）、胆碱、前列腺素、除能因子、蛋白酶抑制因子等。

精胺被精液中的二胺氧化酶氧化，即产生精液的特殊气味。

精液为乳白色半透明的粘稠液体，长期未排精时可稍呈黄色。

有特殊的麝香或樱粟花气味，呈弱碱性pH7.2～8.6，平均7.8，比重1.021～1.040，渗透压20.55～0.58。

射精后的体外精液接触空气，由于受精囊腺分泌的凝固酶的作用，约5min内凝结成胶冻状。

继而在中性蛋白酶及纤溶酶作用下，约20～30min内液化成稀薄半流动体状。

（二）精子形态特点（Thecharacteristicsofsemenmorpha）

正常精子分头、尾两部分，长约60μm，外形似蝌蚪，头部长3～5μm，宽2～3μm，厚1～2μm，正面观呈卵圆形，侧面观呈梨形，主要由顶体（acrosome）和致密的精子细胞核组成。

（Normalspermseparateintoheadandtailtwoparts,about60μm,shapeliketadpoles,theheadofitisabout3~5μmlongth,2~3μmwidth,1~2μmthickness,ovalfrontview,sideviewwaspear-shaped,mainlyconsistedofacrosomeanddensecompositionofthespermnucleus.）空泡状顶体覆盖了精子细胞核的前2/3，内含多种水解酶，如顶体蛋白酶、透明质酸酶、酸性磷酸酶等，在受精时有利于精子穿透卵子外周的放射冠与透明带而进入卵内。

精子细胞核除含有染色质外，还含有各种大小的空泡。

尾部长达40～60μm，细长而弯曲。

分为颈段、中段、主段和末段四部分。

受精时，仅头部进入卵细胞，即使有少量线粒体鞘内的mtDNA也进入卵子，其与卵子所含的上万数目的mtDNA相比，几乎对基因型不产生影响，故mtDNA呈母系遗传。

（三）精液斑的特点（Thecharacteristicsofseminalstain）

1.定义：

精液斑是精液浸润或附着于基质上，干燥后形成的斑痕。

（Thesemendriedoutsidethebodycalledseminalstain.）

2.精斑存在的位置（Thepositionthatseminalmayexist）：

精斑多附着于犯罪嫌疑人或被害人的衣、裤上，女性的外阴部或大腿内侧，现场的被褥、毛巾、纸张、草席、床板、沙石、泥土等。

此外，阴道擦拭物（Vaginalswabs）也是常见的精斑检材。

（Theseminalstainmayexistinsuspectorvictim,sometimeinthecasescene,especiallyinthevaginalswabs.）

精斑无固定的形态，外观常因附着物不同而有差异,新鲜精斑有特殊腥气味（Spermhasnofixedshape,appearanceoftendifferduetotheattachments,freshsemenstainswithspecialfishyodor.）：

（1）在体表，精斑常呈白色鳞片状痂片（Whitescalycrustslice）。

（2）在深色纺织品（Darktextiles）上，浓厚精斑呈灰白色浆糊状斑迹（Thicksemenstainispastypale），偶可见结痂（sometimesscab）；较稀薄的精斑浸润于布纤维间，则不易察见。

（3）在浅色纺织品上，精斑多呈黄白色地图状，边缘色深。

用放大镜检查，可在布纤维表面或中间见黄白色小鳞片。

（4）在软质载体，如衣、裤、纸张上的精斑手触之有硬感。

二、精斑检验的目的与要求

（Thepurposesandrequirementsofbloodstaininspection.）

1.精斑检验的主要目的：

为案件的侦查提供线索，为分析、审理案件提供证据。

（Themainpurposeofseminalinspection:

Providecluesfortheinvestigationofcases,provideevidenceforanalyseandjudgethecases.）

2.对疑为精斑的检材需要解决下列问题（Theinspectionofsuspectedseminalstainshouldsolvethefollowingproblems）：

可疑斑痕是否为精斑？

若是精斑，确定精斑的个体来源。

3.检验步骤为：

肉眼观察（VisualInspection）、预试验（TrialTest）、确证试验（ConfirmatoryTest）、种属鉴定（SpeciesIdentification），遗传标记测定（Determinationofgeneticmarkers）。

三、精斑的肉眼检验（Thevisualinspectionofseminalstain）

肉眼检查的目的：

是发现可疑精斑，确定所在部位及分布，以便准确取材检验，提高阳性率。

有时可根据精斑的形态、部位分析有关作案过程。

（Toincreasethepositiverateofthetext,havethevisualinspectiontoensurethedistributionofthesuspicioussemenstains.）

（1）典型的精斑：

呈不规则地图状。

观察并记录斑迹的分布情况、数目、位置、形状、大小、颜色及光泽等。

新鲜精斑触之有干浆糊斑状的硬感，有特殊的腥味。

（2）水洗、雨淋后的，或有色基质上的精斑肉眼比较难观察。

可将检材置于紫外光下于暗处观察。

紫外线检查：

精斑中含有黄素（flavin），在紫外线照射下显银白色荧光，斑痕边缘呈浅紫蓝色。

水洗过、肉眼不能发现的精斑，在紫外线下仍发浅淡的点片状荧光。

（Semenstainsshowsilverfluorescenceundertheultravioletlightwiththepalevioletbluefleckededgebecauseoftheflavin.）

注意：

阴道分泌物、尿液、鼻涕、唾液、乳汁、脓液、肥皂斑、洗涤剂、植物汁液、纺织品中的某些色素、染料、漂白剂、含荧光素的各种载体等在紫外线下也能发与精斑类似的荧光，故紫外线检查阳性结果仅表示斑痕可能是精斑。

精斑过于淡薄，数天或者数年的精斑，可无荧光，故阴性结果不能轻易否定精斑。

优势：

紫外线检查方法简便，不损害检材，不影响检材作其他项目的检验。

一般在肉眼不易辨别时作精斑定位用。

四、精斑的预试验（TheTrialTestofseminalstain）

预试验的目的：

是筛选可疑精斑，故要求方法简单，灵敏度高。

（Thepurposeofthetrialtestisscreeningsuspicioussperm,thustorequirethemethodcanbeeasyoperateandhighsensitivity.）精斑预试验方法很多，常用的方法如下：

一、酸性磷酸酶检验（Acidphosphatasetest）

精液的主要成分前列腺分泌液中含有大量酸性磷酸酶（acidphosphatase，ACP），浓度为540～4000u/ml，较其他体液、分泌液及脏器的含量高100倍以上。

除精液外，部分蔬菜、水果也含少量酸性磷酸酶。

此外，某些避孕药ACP检测也呈弱阳性反应。

故该试验只能作为精斑的预试验。

由于酸性磷酸酶来源于前列腺，无精子的精液ACP试验也呈阳性结果。

精斑中酸性磷酸酶相当稳定，对腐败及高热有较强的抵抗力。

保存10余年的陈旧精斑，夏日室温放置8周的腐败精液及125℃加热30min的精液仍能检出其酶活性，但200℃加热5min则破坏ACP酶活性。

常用磷酸苯二钠显色试验检测酸性磷酸酶。

（一）磷酸苯二钠试验（Kind-King试法）

1．原理：

精液中的酸性磷酸酶可分解磷酸苯二钠，产生萘酚，后者经铁氰化钾作用并

与氨基安替比林结合，生成红色醌类化合物。

2．试剂：

由反应缓冲液和显色液两部分组成。

缓冲液：

磷酸苯二钠0.2g，4-氨基安替比林0.6g，柠檬酸1.4g，1mol/L氢氧化钠12.5ml，蒸馏水加至100ml，加热溶解后置冷水中迅速冷却，加0.5ml氯仿。

显色液：

铁氰化钾3.6g，1mol/L氢氧化钠16.7ml，碳酸氢钠1.4g，蒸馏水加至100ml。

3．方法：

取可疑斑痕0.1cm×0.1cm，最好取斑痕边缘部位，置试管内，加缓冲液3～4滴，经37℃温箱内5-10min后，加等量显色液，立即出现红色为阳性反应，表明检材可能是精斑。

颜色深浅与酸性磷酸酶浓度呈正比，浓度愈高，颜色愈深红，浓度过高可出现红色沉淀。

呈橙黄色为阴性反应，表明检材不是精斑或精斑中的酸性磷酸酶被破坏。

同时剪取无斑痕处检材及己知精斑作阴性与阳性对照。

4.评价：

（1）磷酸苯二钠试验灵敏度较高，稀释20000倍的精液仍呈阳性反应。

被水洗过的淡薄精斑，只要适当延长缓冲液浸泡时间可呈阳性结果。

精液如混有血液并不影响检验，血痕在该试验中呈灰褐色。

由于该试验灵敏度很高，所以操作时，一般按空白部位、可疑精斑、己知精斑的顺序剪取检材，避免污染。

（Highsensitivity）

（2）酸性磷酸酶试验的特异性较差，1g内脏组织如肺、肝、肾、心、胃等，用5ml缓冲液浸泡的浸液以及常见的人体分泌物或者排泄物如鼻涕、汗、唾液、成年男性尿液等也可呈弱阳性反应。

为了排除上述假阳性反应，可在显色后将液体稀释64倍或将试管再放入56℃温箱中10～20min，此时精斑仍维持红色，引起假阳性的红色消褪。

（Poorspecificity）

（3）所有的预试验中除酸性磷酸酶检验外，其他各项试验灵敏度均不高，因此精斑检验和血痕检验不同。

实际上精斑不一定要经过预试验后才进行确证试验，可剪取肉眼可见的斑痕直接进行确证试验。

有时预试验阴性的检材还是要进行确证试验，偶有磷酸苯二钠试验阴性，而查见精子的报道。

五、精斑的确证试验TheConfirmatoryTestofseminalstain

精斑确证试验的目的：

检验精液中的特有成分，阳性结果可以确证精斑。

（Thepurposeofseminalstainconfirmatorytest:

Examinetheuniqueingredientsinsemen,thepositiveresultscanconfirmtheseminalstain.）

精斑确证试验方法很多，主要有以下两类方法：

精子检出法（Spermdetectionmethod）和免疫学方法（Immunologicalmethods）。

一、精子检出法（Spermdetectionmethod）

检出精子是认定精斑最简便、最可靠的方法，不需要特殊试剂和仪器。

精子具有典型而稳定的形态，不易受其他因素影响而改变。

在显微镜下观察到典型精子，即能确证人精斑。

（Thefindofspermisthemostconvenientandreliablemethodtoconfirmtheseminalstain.）

精斑中的精子形态相当稳定，十余年的陈旧精斑也可能查见精子。

镜下观察精子是无色的，一般情况下精子头部有折光，尾部很细。

检材浸泡后涂片观察，常见精子头部和尾分离。

只要检见典型的精子头，也可以确证精斑。

（Itcouldconfirmtheexistenceofsemenstainwhenatypicalspermobservedunderthemicroscope.）

在实际的精斑检验中，常选择合适的浸液及适当的染色方法，以提高精子的检出率。

⒈检材处理取可疑精斑检材1.5cm×1.5cm，剪碎，置试管内，加约0.5ml生理盐水，室温2h，可用玻棒搅拌和压挤检材。

然后置4℃过夜，吸出全部浸液置另一试管内，2500r/min离心5min，上清液留作抗人精液沉淀反应和中和试验。

沉淀物涂片，干燥后甲醇固定5min，染色，检验精子。

过于陈旧的精斑，盐水浸渍不易分离精子，可用5%～10%氨液浸渍，或用0.8%盐酸、醋酸、胰蛋白酶等浸渍，12～24h后弃载体纤维，离心。

沉淀经洗涤后涂片、染色、镜检。

⒉染色方法精子染色方法有单染法和复染法两种。

（1）单染法

使用的染料有藻红、亚甲蓝、苏木素等，其中以藻红染色效果较好。

单染法操作简单，但精子和基质都染成同一颜色，不容易观察。

藻红染色法：

取藻红0.5g，溶于25%氨水100ml配制成藻红染色液。

在涂片上滴加1～2滴染色液，室温下染色3～5min，水淋洗，干燥后二甲苯透明，高倍镜检查。

精子头部和尾部均染呈红色。

亚甲蓝染色法（Loffler法）：

亚甲蓝0.3g，加95%乙醇30ml，0.01mol/LKOH70ml，配制成亚甲蓝染色液。

于涂片上滴加1～2滴染色液，染色1min，水洗，二甲苯透明，盖上盖玻片镜检。

精子头后部染呈深蓝色，头前部、尾部不着色或浅染。

（2）复染法

复染法使用2种或2种以上染料，所以精子头部、尾部和基质染成不同的颜色，便于观察和分辨。

有HE染色法、酸性品红亚甲蓝染色法。

其中以酸性品红亚甲蓝染色法常用。

苏木素伊红（HE）染色法

染色试剂有三种：

A.苏木素染液，称取苏木素0.5g，用无水乙醇5ml溶解。

取明矾10g，在蒸馏水中加热溶解，加入苏木素乙醇液，加热至溶液呈深紫色，加入氧化汞0.25g，迅速冷却。

B.0.5%伊红染液。

C.1%盐酸酒精溶液，取盐酸1ml，加70%酒精至100ml。

染色方法：

在涂片上滴加1～2滴苏木素染液，染色10～30min。

水淋洗后，加1%盐酸酒精5～10s，水洗或在水中浸泡30min后，加伊红染液3min，水淋洗。

干燥后二甲苯透明，镜检。

精子头前半部不着色或浅染，后半部染呈蓝色，尾部染呈红色。

酸性品红亚甲蓝（Baecchi）染色法

染色液：

由1%酸性品红液1ml，1%亚甲蓝81ml，1%盐酸40ml组成。

染色方法：

于涂片上滴加染色液，静置5min，用1%盐酸漂洗，干燥后二甲苯透明，镜检。

精子头部呈红色，尾部蓝色。

本法仅精子染色显著，其他杂质染色浅淡，有利于精子的检出。

显微镜下检见精子需要一定的经验，精斑陈旧、取材部位不准或遇到少精子症者，涂片上往往仅见少量精子，故染色后须仔细地观察，只要找到一个完整的典型精子，即能确证人精斑。

精斑在浸渍处理过程中，精子尾部断落，常只检见精子头部，应与阴道滴虫、酵母菌等鉴别。

典型的精子头部呈椭圆形，着色特殊，其它植物细胞、细菌、阴道滴虫等则多呈圆形，染色均匀一致。

若发现几个典型的精子头部也可确证为精斑。

3.精子的检出时间

性交后精子可以存活一段时间，一般情况下阴道（vagina）内3～8h，宫颈（cervix）2～5天，子宫（uterus）、输卵管（oviduct）内1～10天的拭子内容物涂片可检见活精子。

阴道内3～9天，宫颈17天的内容物涂片可检见死精子。

精子的检出期限与被害人的体位、活动情况以及月经周期有关。

被害人处于月经期前后或被强奸后就行走，精子检出期限短。

在性犯罪调查中，取阴道拭子的时间越早越好，如果在24h后取材阴道拭子，精子检测阳性率下降50%，48h取材，阳性率仅10%。

活体阴道拭子，精子检出期限一般1.5～2天。

若被害人死亡，尸体处于仰卧位，则检出期限较长，阴道拭子中精子不仅数目多、而且形态基本完整，最长的检出期限可达3周。

而冰冻2个半月的尸体，宫颈涂片偶能检出精子。

精子检出率也与阴道拭子提取方法与部位有关，例如宫颈刮片和阴道后穹窿部擦拭物精子的检出率较高。

二、免疫学试验（Immunologicalmethods）

制备各种抗人精液特殊成分的抗血清，用免疫学试验，如沉淀反应、酶联免疫吸附试验、胶体金标记试验等检测相应抗原，可以确证精斑。

该试验灵敏度高，还可以确证输精管结扎术者和精子缺乏症患者的精斑。

常用的有抗人精液血清和抗-p30血清进行的反应。

1.胶体金法

胶体金法是一种免疫层析技术，用胶体金p30抗原检测试剂条，又称PSA（prostatespecificantigen）试剂条进行精斑确证试验，特异性好，灵敏度高，稀释6000倍的精液仍可获阳性结果。

另外，试验操作简单，整个试验过程可在5min内完成，是目前一项常规技术。

（Ignorethedisturbofazoospermia,ligation,vaginalfluidorsaliva,anti-p30couldpickouthumansemenstaincorrectly.）

（1）原理及方法

精斑确证试验胶体金标记的是鼠抗人p30单克隆抗体，检测线包被有另一种鼠抗人p30单克隆抗体，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。

精斑确证试验在实际工作中可联合使用，如精子检查及抗人精液血清环状沉淀试验均得阳性结果，可以认定精斑，如果二者均为阴性结果，可以否定精斑。

六、精斑的个人识别（Theindividualidentificationofseminalstain）

精斑检验的主要目的：

是进行个人识别，确定现场精斑是谁所遗留。

目前精斑个人识别的方法己取得了很大的进展。

精斑检验传统的遗传标记主要有ABO血型、酶型、血清型等，但是DNA多态性的应用发展很快，应用价值最大。

（一）精斑的ABO血型测定（TheinspectionofseminalstainABOtype）

ABH血型物质以水溶性形式存在于人的体液、分泌液中，属糖蛋白。

分泌型人精液中ABH血型物质与唾液中含量相似，常用中和试验检测；非分泌型精液由于ABH血型物质含量少，需用灵敏的ELISA法检测。

1、中和试验（NeutralizationTest）

中和试验是一种检测可溶性血型物质的传统方法。

【试验原理】

红细胞凝集抑制试验（Hemagglutinationinhibitiontest）。

精斑检材中可溶性血型抗原与相应的抗体结合，使抗体的效价下降或消失，凝集红细胞的能力下降或消失。

用已知型别指示红细胞检测中和后的抗体效价，凝集能力下降或消失，红细胞不凝集为试验阳性，说明精斑检材具有相应的血型抗原。

【结果说明】

精斑中ABH物质量必需与相应抗血清中所含的抗体量相当，才能完全中和抗体，获得准确的结果。

因此传统的中和法是一种半定量检测，需要将精斑浸液作一系列的稀释度，各稀释液含有不同量的ABH抗原，能充分中和标化抗血清中的抗体，再加指示红细胞。

精斑检材分别与抗-A、抗-B抗体及抗-H试剂作中和试验，综合三者反应结果，判定分泌型精斑的ABO血型及分泌能力的强弱。

【方法】

抗血清效价标定

取12凹白瓷板一块，以2滴抗血清加2滴生理盐水作2-4倍数系列稀释，直至1/2048。

笫12凹为空白盐水对照。

向每凹加入1滴2%指示红细胞悬液，摇匀，室温置30min，观察结果。

能使红细胞凝集的抗体最高稀释倍数即为该抗血清的效价。

若抗血清的效价为128时，要将之标化为2，应该稀释64倍。

中和试验

取精斑0.5cm2，剪碎置小试管内，加0.5ml生理盐水，搅拌后室温下2h，4℃冰箱中过夜。

取精斑浸出液，在白瓷板内分三列用生理盐水作倍量稀释，稀释度由1/2至1/128。

于三列稀释液中分别加入等体积的效价为1：

2的抗-A、抗-B抗体及抗-H试剂，摇匀，室温下中和30min。

再向三列各凹加入2%指示红细胞悬液各1滴，摇匀后静置30min，观察红细胞凝集情况。

以己知ABO血型的分泌型人唾液作阳性对照，以检材无斑痕部分作阴性对照。

在己知对照正确的情况下，精斑检材与无精斑检材的抑制凝集相差3级以上，证明精斑中含有相应的血型物质