鬼针草总黄酮的抗炎作用及部分机制研究精品.docx

1、鬼针草总黄酮的抗炎作用及部分机制研究精品 安徽医 科大 学硕 士学 位论 文分类号 : 密级:U D C : 编号: 学 位 论 文鬼针草总黄酮的抗炎作用 及部分 机制研究Anti-inflammatory Effect Of Total Flavones of Bidens Bipinnata L TFB And The Possible Mechanisms 林 梅 英指 导教 师姓名 陈飞虎 教授 安 徽医 科大 学药学 院申 请学 位级别硕士 专 业 名 称药理 学提 交论 文日期 2013-05论 文 答辩 日期 2013-06 学 位论 文授予 单位 和日期 安 徽 医科 大学 答

2、辩 委员 会主席 评 阅 人 2013 年 6 月 安徽医 科大 学硕 士学 位论 文安徽医科大学ANHUI MEDICAL UNIVERSITY硕 士 学 位 论 文论 文 题目 鬼针草总黄酮的抗炎作用 及部分机制研究 Anti-inflammatory Effect Of Total Flavones of Bidens Bipinnata L TFB And The Possible Mechanisms作 者 姓 名林 梅 英 指 导 教 师陈 飞 虎 学科、 专业药理学 研 究 方 向分 子 药理学 论文工作日期 2011.4-2013.4本 课 题 受 国 家 科 技 重 大 专

3、项 重 大 新 药 创 制 项 目 资 助 , 项 目 编 号 :2009ZX09102-3862013 年 6 月安徽医 科大 学硕 士学 位论 文 学 位论文 独创性声 明 本人所 呈交 的论 文是 我个 人在导 师指 导下 进行 的研 究工作 及取 得的 研究 成果 。 据 我 所知, 除 了文 中特 别加 以标 注和致 谢的 地方 外, 论文 中不包 含其 他人 已经 发表 或撰写 过的 研究成果 。 与我 一同 工作 的 同志对 本研 究所 做的 任何 贡献均 已在 论文 中作 了明 确说明 并表 示谢意。 学位论文 作者签 名: 日 期:学 位论文 使用授权 声明 本人完全了解安徽

4、医科大学有关保留、 使用学位论文的规定: 学校有权保留学位论文 并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版, 有权允许论文进入学校图书馆被查阅, 有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索, 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 愿意将本人的学位论文提交 中国博士学位论文全文数据库 、 中国优秀硕士学位论文全文数据库 和 中国学位论文全文数据库 中全文发表, 并可以以电子、 网络及其他数字媒体形式公开出版, 并同意编入 CNKI 中国知识资源 总库 , 在 中国博硕 士学位论文评价数据库 中使用和在互联网上传播。 保密的学位论文在解密后适用本规定。学位论文作者签名: 导师签名:日期:

5、日期: 安徽医 科大 学硕 士学 位论 文目录英 文缩略 词表1 中 文摘要3 英 文 摘 要 6 正文1 前言 10 2 实验材料 10 3 实验方法 12 4 结果 19 5 讨论 36 6 结论 44 参考文献 45 附 录51 致 谢53 综 述55 参 考 文 献69安徽医 科大 学硕 士学 位论 文英文缩略词表 Abbreviation英文缩写 英文全称 中文全文 AA Adjuvant arthritis 佐剂性关节炎 ASIC1a Acid sensing ion channel 1a 酸敏感离子通道 1a 型 ASICs Acid sensing ion channels 酸

6、敏感离子通道 CMC-Na Sodium carboxymethyl cellulose 羧甲基纤维素钠 d Day 天 细胞外基质 ECM Extracellular matrix EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸 酶联免疫吸附测定 ELISA Enzyme linked immunosorbent assay FCA Freunds complete adjuvant 弗氏完全佐剂 g Gram 克 h Hour 小时 HE Hematoxylin-Eosin 苏木精- 伊红染色 ig Intragastric injection

7、administration灌胃 IL Interleukin 白细胞介素 LefLeflunomide 来氟米特 mg Milligramme 毫克 Milliliter mL 毫升1 安徽医 科大 学硕 士学 位论 文min Minute 分 N.S. Normal saline 生理盐水 OD Optical density 光密度 OPG Osteoprotegerin 骨保护素 PBS Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 PI Polyarthritis index多发性关节炎指数 RA Rheumatoid arthritis 类风湿性关节炎 RANK

8、 Receptor activator for nuclear 核因子 B 受体活化因子 factor- BRANKL Receptor activator for nuclear 核因子 B 受体活化因 子factor- B ligand 配体 rpm Revolution per minute 转/ 分 s Second 秒 TFB Total flavones of bidens bipinnata L 鬼针草总黄酮 TNF- Tumor necrosis factor- 肿瘤坏死因子- W Week 周2 安徽医 科大 学硕 士学 位论 文鬼针草总黄酮的抗炎作用 及部分机制研究 研究生

9、 林梅英 导 师 陈飞虎 教授 (安徽医科大学药学院,合肥,230032)中文摘要 鬼针草Bidens bipinnata L. 为菊科Compositae 管状花亚科鬼针草属Bidens L.药用植物 , 鬼针草总黄酮 total flavones of Bidens bipinnata L,TFB 是 以本课题组以金盏银盘为原料获得 的鬼针草乙醇提取物 。前期 研究证实 TFB 为鬼 针草的有效成分, 对 CCL 诱导的化学性急性肝损伤 及肝纤维化 、 猪血清诱导的免疫性肝纤维化4及 血 吸 虫 病 肝 纤 维 都 有 一 定 的 治 疗 作 用 。 本 研 究 拟 建 立 急 、 慢 性

10、 炎 症 模 型 , 观 察TFB 的抗炎作用并探讨 其可能机制。目的 : 采 用 急 性 炎 症 模 型 和 免 疫 性 炎 症 模 型 研 究鬼针草总黄酮Total flavones of bidens bipinnata L, TFB 的抗炎作用,并探讨其可能作用机制 。方法 : 1. 采用 二甲苯诱导急性小鼠耳肿胀 模型, 测量小鼠 耳肿胀度和 EILSA 检测小鼠血清 TNF- 、IL-1、IL-6 和 IL-8 含量,以观察 鬼针草总黄 酮对急性小鼠耳肿胀的作用及可能机制。 2. 采用 弗氏完全佐剂Freunds complete adjuvant, FCA 足趾皮内注射诱导 大鼠

11、 佐剂 性 关 节 炎 模 型 。 测 定 大 鼠 原 发 性 足 肿 胀 度 ,采用 ELISA 方 法 检 测 大 鼠 血清TNF- 、IL-1、IL-2 、IL-6 和 IL-8 含量,HE 染色观察大鼠关节病理组织学变化 ,免疫组织化学法检测 大鼠关节软骨组织 ASIC1a 蛋白的表达, 验证鬼针草总黄酮对佐 剂 性 关 节 炎 大 鼠 的 原 发 性 炎 症 的 保 护 作 用 及 可能作用 机制 ; 并 通 过 继 发 性 足肿胀度 、 多发性关节炎指数PI 等指标观察鬼针 草总黄酮对佐 剂性关节炎大鼠继发性3 安徽医 科大 学硕 士学 位论 文炎症的治疗作用, 采用 ELISA

12、方法检测继发 性炎症大鼠 血清 TNF- 、IL-1、IL-2、IL-6 和 IL-8 的含量 ,HE 染色观察 大鼠关节 病理组织学变化,并采用 免疫组织化学法检测 大鼠关节软骨组织 OPG、RANKL 和 ASIC1a 蛋白的表达, 以期阐明 鬼针草总黄酮对 佐剂性关节炎大鼠继发性炎症 的治疗作用机制。结果: 1. 与 正 常 组 比 较 , 二 甲 苯 诱 导 的 模 型 小 鼠 耳 肿 胀 程 度 显 著 增 加P0.05 ,血清-1TNF- 、IL-1、IL-6 和 IL-8 含量均 明显升高P0.05 ,TFB100 、200 mg? kg ig给药 3 天能明显减轻 二甲苯诱导的

13、小鼠 耳肿胀 程度P0.05,并 使耳 肿胀小鼠 血清中升高的 TNF- 、IL-1 、IL-6、IL-8 含量显著 降低P0.05 。 2. FCA 足趾皮内注射 6 h 后 AA 模型大鼠致炎 侧开始 出现足肿胀, 并在 18 h 肿-1 胀度达到顶峰,其后开始减弱。TFB 67、133 mg? kg ig 给药 3 天 显著减轻 AA大鼠原发性 足肿胀程度; 与正常组比较, AA 模型组大鼠原发性炎症期 血清 TNF- 、-1IL-1、IL-6 和 IL-8 含 量均明显升高,IL-2 含 量明显降低 ,TFB67 、133 mg? kg ig给药 可以 明显 升 高 大 鼠 血 清 I

14、L-2 的含量P0.05 , 能 在 一 定 程 度 上 降 低 血 清-1TNF- 、IL-1、IL-6 和 IL-8 含量,病理组织 学结果显示 TFB67 、133 mg? kg ig给药 3 天可以使 AA 大鼠关节炎性细胞减少, 减轻炎性浸润,改善病理变化 ,免疫 组 织 化 学 法 结 果 显 示 模 型 组 大 鼠 关 节 软 骨 组 织 ASIC1a 表 达 明 显 升 高 , 而-1TFB67 、133 mg? kg 组 ASIC1a 的表达明显 降低。 与正常组比较,FCA 足 趾皮内注射后 d12、d16、d20、d24、d28 AA 模型大鼠非 致炎侧 踝 关 节 肿

15、胀 明显P0.05 ,且多发性关节炎指数显著增加P0.05 ,提示-1FCA 足趾皮内注射 可诱 导大鼠继发性炎症。TFB67 、133 mg? kg ig 给药能明显增加大鼠体重, 减轻 d12 、d16、d20、d24、d28 AA 大鼠继发性足肿胀 度 , 降低多 发性关节炎指数。 ELISA 结果显示 AA 模型大鼠 继发性炎症期 血清 TNF- 、 IL-1、 IL-6-1和 IL-8 含量显著升高 而 IL-2 水平降低P0.05 ,TFB67 、133 mg? kg ig 给药可降低 血清 TNF- 、IL-1 、IL-6 和 IL-8 含量, 升高血清 IL-2 含量; 病理组

16、织学检查结果证实 TFB 能改善 大鼠关节炎症症状并在一定程度上减轻 软骨破坏 ,免疫组织4 安徽医 科大 学硕 士学 位论 文化 学 法 结 果 表 明 TFB 给药组 关 节 软 骨 组 织 OPG 蛋 白 表 达 上 调 , 而 ASIC1a 和RANKL 蛋白表达 下调 。结论: 鬼针草总黄酮对二甲苯诱导的急性炎症和 FCA 诱导的急、 慢性炎症 均有一定程 度 的 抑 制 作 用 , 其 对 急 性 炎 症 的 保 护 机 制 可 能 与 减 少 炎 症 介 质 释 放 有 关 ;而 对慢性 免疫性炎症 的保护作用则通过下调 ASIC1a 表达继而调节细胞因子网络平衡 、影响 RAN

17、KL/OPG 通路 活性 ,最终减轻软骨破坏 。关键词 :鬼针草总黄酮 耳肿胀 佐剂性关节炎 RANKL OPG ASICs5 安徽医 科大 学硕 士学 位论 文Anti-inflammatory Effect Of Total Flavones of Bidens Bipinnata LTFB And The Possible MechanismsPh.M candidate: Lin Mei-ying Supervisor: Prof. Chen Feihu School of Pharmacy, Anhui Medical University, Hefei, 230032ABSTRAC

18、T Total flavones of Bidens bipinnata LTFB is the ethanol extracts obtained from Bidens bipinnata L., which is a medicinal plant of Compositae tubular flower subfamily Bidens LResults of our previous studies confirmed that TFB was the effective component of Bidens bipinnata, with obvious therapeutic

19、effects on inflammation associated diseases including acute chemical liver injury and hepatic fibrosis induced by CCL immune hepatic fibrosis induced by pig serum, and hepatic fibrosis induced by 4 , schistosomiasis. The aim of the present study is to investigate the anti-inflammatory effect of TFB

20、using acute and chronic inflammation models and to explore its possible mechanism OBJECTIVE To investigate the anti-inflammatory effect of TFB using acute and chronic inflammation models and to explore its possible mechanism METHODS1. The acute inflammatory mice model was induced by smearing dimethy

21、lbenzene to mice ear. The degree of ear edema was measured, and the serum concentrations of tumor necrosis factor- TNF-, Interleukin-1 IL-1, IL-6 and IL-8 were detected using enzyme linked immunosorbent assay ELISA 6 安徽医 科大 学硕 士学 位论 文2. Freunds complete adjuvant FCA was injected intradermally to est

22、ablish AA rat model. To investigate the effect of TFB on the FCA-induced acute primary inflammation, the swelling degrees of the injection paw were measured 0, 6, 12, 18, 24h after FCA injected, and the serum contents of tumor necrosis factor- TNF-, interleukin-1 IL-1, IL-2, IL-6 and IL-8 were detec

23、ted using enzyme linked immunosorbent assay ELISA. The histopathological changes of rats joint were observed using hematoxylin-eosin HE staining, and the protein expression of ASIC1a in cartilage tissue of AA rats was detected using immunohistochemistryTo explore the effect of TFB on the FCA-induced

24、 chronic secondary inflammation, the swelling degree of contralateral non-inflamed paws were measured, and the polyarthritis index PI were evaluated. Serum concentrations of TNF-, IL-1, IL-2, IL-6 and IL-8 in the secondary stage of AA rats were detected by ELISA, The histopathological changes of rat

25、s joint were observed using HE staining, and the protein expression of OPG, RANKL and ASIC1a in cartilage tissue of AA rats was detected using immunohistochemistry RESULTS 1. Compared with those of the normal mices, the ear edema degree and serum concentrations of TNF-, IL-1, IL-6, IL-8 in the model

26、 mice were obviously -1increasedP0.05. Administration of TFB100,200 mg? kg ig lasted three days could suppress the ear edema induce by dimethylbenzene and decrease serum TNF-, IL-1, IL-6, IL-8 contentsP0.052 The paws of the inflammatory side in AA rats began swellen 6 h after intradermal injection w

27、ith FCA, and the swelling degree reached the peak at 18 h then began to -1wane. Administration of TFB67,133 mg? kg ig for three days could significantly reduce the primary foot swelling degree of AA rats; compared with those of the normal group, serum contents of TNF- , IL-1, IL-6 and IL-8 in AA mod

28、el rats were7 安徽医 科大 学硕 士学 位论 文-1significantly increased whereas IL-2 content decreased obviously, TFB 67,133 mg? kg ig could significantly reduce serum TNF- , IL-1, IL-6 and IL-8 content and elevate the serum IL-2 level. The histopathological changes in the knee joint of AA rats including the incre

29、asing number of inflammatory cells and inflammatory infiltration could be ameliorated by TFB. The expression of ASIC1a protein in the cartilage tissue of AA rats during primary inflammation phase was upregulated, which could be downregulated by -1treatment with TFB67, 133 mg? kg Compared with the no

30、rmal group, the contralateral non-inflamed paws of AA rats were swellen d12, d16, d20, d24, d28 after intradermal injection of FCA, and the polyarthritis index increased significantly, indicating the FCA-induced secondary inflammation of AA rats. Consistent with these results, the serum concentrations of TNF-, IL-1, IL-6 and IL-8 were elevated in AA group. Treatment with TFB 67, 133 -1mg? kg could increase the body weight gain, weaken AA rats secondary palm swelling and