鬼针草总黄酮的抗炎作用及部分机制研究精品.docx

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鬼针草总黄酮的抗炎作用及部分机制研究精品

安徽医科大学硕士学位论文

分类号:

密级:

UDC:

编号:

学位论文鬼针草总黄酮的抗炎作用及部分机制研究

Anti-inflammatoryEffectOfTotalFlavonesofBidens

BipinnataLTFBAndThePossibleMechanisms

林梅英指导教师姓名陈飞虎教授安徽医科大学药学院

申请学位级别硕士专业名称药理学

提交论文日期2013-05论文答辩日期2013-06

学位论文授予单位和日期安徽医科大学答辩委员会主席评阅人

2013年6月安徽医科大学硕士学位论文

安徽医科大学

ANHUIMEDICALUNIVERSITY

硕士学位论文

论文题目鬼针草总黄酮的抗炎作用及部分

机制研究

Anti-inflammatoryEffectOfTotalFlavonesofBidens

BipinnataLTFBAndThePossibleMechanisms

作者姓名林梅英

指导教师陈飞虎

学科、专业药理学

研究方向分子药理学

论文工作日期2011.4-2013.4

本课题受国家科技重大专项重大新药创制项目资助,项目编号:

2009ZX09102-386

2013年6月安徽医科大学硕士学位论文

学位论文独创性声明

本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

据我所

知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研

究成果。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并表示

谢意。

学位论文作者签名:

日期:

学位论文使用授权声明

本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定:

学校有权保

留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版,有权

允许论文进入学校图书馆被查阅,有权将学位论文的内容编入有关数据库进行

检索,有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。

愿意将本人的学位论文提交《中

国博士学位论文全文数据库》、《中国优秀硕士学位论文全文数据库》和《中国

学位论文全文数据库》中全文发表,并可以以电子、网络及其他数字媒体形式

公开出版,并同意编入CNKI《中国知识资源总库》,在《中国博硕士学位论文

评价数据库》中使用和在互联网上传播。

保密的学位论文在解密后适用本规定。

学位论文作者签名:

导师签名:

日期:

日期:

安徽医科大学硕士学位论文

目录

英文缩略词表……………………………………………………………1

中文摘要…………………………………………………………………3

英文摘要………………………………………………………………6

正文

1前言……………………………………………………………10

2实验材料………………………………………………………10

3实验方法………………………………………………………12

4结果……………………………………………………………19

5讨论……………………………………………………………36

6结论……………………………………………………………44

参考文献…………………………………………………………45

附录………………………………………………………………51

致谢………………………………………………………………53

综述………………………………………………………………55

参考文献………………………………………………………………69

安徽医科大学硕士学位论文

英文缩略词表

Abbreviation

英文缩写英文全称中文全文

AAAdjuvantarthritis佐剂性关节炎

ASIC1aAcidsensingionchannel1a酸敏感离子通道1a型

ASICsAcidsensingionchannels酸敏感离子通道

CMC-NaSodiumcarboxymethylcellulose羧甲基纤维素钠

dDay天

细胞外基质

ECMExtracellularmatrix

EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸

酶联免疫吸附测定

ELISAEnzymelinkedimmunosorbent

assay

FCAFreund’scompleteadjuvant弗氏完全佐剂

gGram克

hHour小时

HEHematoxylin-Eosin苏木精-伊红染色

igIntragastricinjectionadministration灌胃

ILInterleukin白细胞介素

LefLeflunomide来氟米特

mgMilligramme毫克

Milliliter

mL毫升1安徽医科大学硕士学位论文

minMinute分

N.S.Normalsaline生理盐水

ODOpticaldensity光密度

OPGOsteoprotegerin骨保护素

PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液

PIPolyarthritisindex多发性关节炎指数

RARheumatoidarthritis类风湿性关节炎

RANKReceptoractivatorfornuclear核因子κB受体活化因子

factor-κBRANKLReceptoractivatorfornuclear核因子κB受体活化因子

factor-κBligand配体

rpmRevolutionperminute转/分

sSecond秒

TFBTotalflavonesofbidensbipinnataL鬼针草总黄酮

TNF-αTumornecrosisfactor-α肿瘤坏死因子-α

WWeek周

2安徽医科大学硕士学位论文

鬼针草总黄酮的抗炎作用及部分机制研究

研究生林梅英

导师陈飞虎教授

（安徽医科大学药学院,合肥,230032）

中文摘要

鬼针草BidensbipinnataL.为菊科Compositae管状花亚科鬼针草属BidensL.

药用植物,鬼针草总黄酮totalflavonesofBidensbipinnataL,TFB是以本课题组以

金盏银盘为原料获得的鬼针草乙醇提取物。

前期研究证实TFB为鬼针草的有效成

分,对CCL诱导的化学性急性肝损伤及肝纤维化、猪血清诱导的免疫性肝纤维化

4

及血吸虫病肝纤维都有一定的治疗作用。

本研究拟建立急、慢性炎症模型,观察

TFB的抗炎作用并探讨其可能机制。

目的:

采用急性炎症模型和免疫性炎症模型研究鬼针草总黄酮Totalflavonesof

bidensbipinnataL,TFB的抗炎作用,并探讨其可能作用机制。

方法:

1.采用二甲苯诱导急性小鼠耳肿胀模型,测量小鼠耳肿胀度和EILSA检测小鼠血

清TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8含量,以观察鬼针草总黄酮对急性小鼠耳肿胀的作

用及可能机制。

2.采用弗氏完全佐剂Freund’scompleteadjuvant,FCA足趾皮内注射诱导大鼠佐

剂性关节炎模型。

测定大鼠原发性足肿胀度,采用ELISA方法检测大鼠血清

TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6和IL-8含量,HE染色观察大鼠关节病理组织学变化,

免疫组织化学法检测大鼠关节软骨组织ASIC1a蛋白的表达,验证鬼针草总黄酮对

佐剂性关节炎大鼠的原发性炎症的保护作用及可能作用机制;并通过继发性足肿

胀度、多发性关节炎指数PI等指标观察鬼针草总黄酮对佐剂性关节炎大鼠继发性

3安徽医科大学硕士学位论文

炎症的治疗作用,采用ELISA方法检测继发性炎症大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-2、

IL-6和IL-8的含量,HE染色观察大鼠关节病理组织学变化,并采用免疫组织化

学法检测大鼠关节软骨组织OPG、RANKL和ASIC1a蛋白的表达,以期阐明鬼针

草总黄酮对佐剂性关节炎大鼠继发性炎症的治疗作用机制。

结果:

1.与正常组比较,二甲苯诱导的模型小鼠耳肿胀程度显著增加P0.05,血清

-1

TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8含量均明显升高P0.05,TFB100、200mg?

kgig

给药3天能明显减轻二甲苯诱导的小鼠耳肿胀程度P0.05,并使耳肿胀小鼠血清

中升高的TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8含量显著降低P0.05。

2.FCA足趾皮内注射6h后AA模型大鼠致炎侧开始出现足肿胀,并在18h肿

-1

胀度达到顶峰,其后开始减弱。

TFB67、133mg?

kgig给药3天显著减轻AA

大鼠原发性足肿胀程度;与正常组比较,AA模型组大鼠原发性炎症期血清TNF-α、

-1

IL-1、IL-6和IL-8含量均明显升高,IL-2含量明显降低,TFB67、133mg?

kgig

给药可以明显升高大鼠血清IL-2的含量P0.05,能在一定程度上降低血清

-1

TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8含量,病理组织学结果显示TFB67、133mg?

kgig

给药3天可以使AA大鼠关节炎性细胞减少,减轻炎性浸润,改善病理变化,免

疫组织化学法结果显示模型组大鼠关节软骨组织ASIC1a表达明显升高,而

-1

TFB67、133mg?

kg组ASIC1a的表达明显降低。

与正常组比较,FCA足趾皮内注射后d12、d16、d20、d24、d28AA模型大鼠

非致炎侧踝关节肿胀明显P0.05,且多发性关节炎指数显著增加P0.05,提示

-1

FCA足趾皮内注射可诱导大鼠继发性炎症。

TFB67、133mg?

kgig给药能明显增

加大鼠体重,减轻d12、d16、d20、d24、d28AA大鼠继发性足肿胀度,降低多发

性关节炎指数。

ELISA结果显示AA模型大鼠继发性炎症期血清TNF-α、IL-1、IL-6

-1

和IL-8含量显著升高而IL-2水平降低P0.05,TFB67、133mg?

kgig给药可

降低血清TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8含量,升高血清IL-2含量;病理组织学检查

结果证实TFB能改善大鼠关节炎症症状并在一定程度上减轻软骨破坏,免疫组织

4安徽医科大学硕士学位论文

化学法结果表明TFB给药组关节软骨组织OPG蛋白表达上调,而ASIC1a和

RANKL蛋白表达下调。

结论:

鬼针草总黄酮对二甲苯诱导的急性炎症和FCA诱导的急、慢性炎症均有一定

程度的抑制作用,其对急性炎症的保护机制可能与减少炎症介质释放有关;而对

慢性免疫性炎症的保护作用则通过下调ASIC1a表达继而调节细胞因子网络平衡、

影响RANKL/OPG通路活性,最终减轻软骨破坏。

关键词:

鬼针草总黄酮耳肿胀佐剂性关节炎RANKLOPGASICs

5安徽医科大学硕士学位论文

Anti-inflammatoryEffectOfTotalFlavonesofBidens

BipinnataLTFBAndThePossibleMechanisms

Ph.Mcandidate:

LinMei-ying

Supervisor:

Prof.ChenFeihu

SchoolofPharmacy,AnhuiMedicalUniversity,Hefei,230032

ABSTRACTTotalflavonesofBidensbipinnataLTFBistheethanolextractsobtainedfrom

BidensbipinnataL.,whichisamedicinalplantofCompositaetubularflowersubfamily

BidensLResultsofourpreviousstudiesconfirmedthatTFBwastheeffective

componentofBidensbipinnata,withobvioustherapeuticeffectsoninflammation

associateddiseasesincludingacutechemicalliverinjuryandhepaticfibrosisinducedby

CCLimmunehepaticfibrosisinducedbypigserum,andhepaticfibrosisinducedby

4,

schistosomiasis.Theaimofthepresentstudyistoinvestigatetheanti-inflammatory

effectofTFBusingacuteandchronicinflammationmodelsandtoexploreitspossible

mechanism

OBJECTIVE

Toinvestigatetheanti-inflammatoryeffectofTFBusingacuteandchronic

inflammationmodelsandtoexploreitspossiblemechanism

METHODS1.Theacuteinflammatorymicemodelwasinducedbysmearingdimethylbenzeneto

miceear.Thedegreeofearedemawasmeasured,andtheserumconcentrationsof

tumornecrosisfactor-αTNF-α,Interleukin-1IL-1,IL-6andIL-8weredetected

usingenzymelinkedimmunosorbentassayELISA6安徽医科大学硕士学位论文

2.Freund’scompleteadjuvantFCAwasinjectedintradermallytoestablishAArat

model.ToinvestigatetheeffectofTFBontheFCA-inducedacuteprimary

inflammation,theswellingdegreesoftheinjectionpawweremeasured0,6,12,18,24h

afterFCAinjected,andtheserumcontentsoftumornecrosisfactor-αTNF-α,

interleukin-1IL-1,IL-2,IL-6andIL-8weredetectedusingenzymelinked

immunosorbentassayELISA.Thehistopathologicalchangesofratsjointwere

observedusinghematoxylin-eosinHEstaining,andtheproteinexpressionofASIC1a

incartilagetissueofAAratswasdetectedusingimmunohistochemistryToexploretheeffectofTFBontheFCA-inducedchronicsecondaryinflammation,

theswellingdegreeofcontralateralnon-inflamedpawsweremeasured,andthe

polyarthritisindexPIwereevaluated.SerumconcentrationsofTNF-α,IL-1,IL-2,

IL-6andIL-8inthesecondarystageofAAratsweredetectedbyELISA,The

histopathologicalchangesofratsjointwereobservedusingHEstaining,andtheprotein

expressionofOPG,RANKLandASIC1aincartilagetissueofAAratswasdetected

usingimmunohistochemistry

RESULTS

1.Comparedwiththoseofthenormalmices,theearedemadegreeandserum

concentrationsofTNF-α,IL-1,IL-6,IL-8inthemodelmicewereobviously

-1

increasedP0.05.AdministrationofTFB100,200mg?

kgiglastedthreedayscould

suppresstheearedemainducebydimethylbenzeneanddecreaseserumTNF-α,IL-1,

IL-6,IL-8contentsP0.052ThepawsoftheinflammatorysideinAAratsbeganswellen6hafterintradermal

injectionwithFCA,andtheswellingdegreereachedthepeakat18hthenbeganto

-1

wane.AdministrationofTFB67,133mg?

kgigforthreedayscouldsignificantly

reducetheprimaryfootswellingdegreeofAArats;comparedwiththoseofthenormal

group,serumcontentsofTNF-α,IL-1,IL-6andIL-8inAAmodelratswere7安徽医科大学硕士学位论文

-1

significantlyincreasedwhereasIL-2contentdecreasedobviously,TFB67,133mg?

kg

igcouldsignificantlyreduceserumTNF-α,IL-1,IL-6andIL-8contentandelevatethe

serumIL-2level.ThehistopathologicalchangesinthekneejointofAAratsincluding

theincreasingnumberofinflammatorycellsandinflammatoryinfiltrationcouldbe

amelioratedbyTFB.TheexpressionofASIC1aproteininthecartilagetissueofAArats

duringprimaryinflammationphasewasupregulated,whichcouldbedownregulatedby

-1

treatmentwithTFB67,133mg?

kg

Comparedwiththenormalgroup,thecontralateralnon-inflamedpawsofAArats

wereswellend12,d16,d20,d24,d28afterintradermalinjectionofFCA,andthe

polyarthritisindexincreasedsignificantly,indicatingtheFCA-inducedsecondary

inflammationofAArats.Consistentwiththeseresults,theserumconcentrationsof

TNF-α,IL-1,IL-6andIL-8wereelevatedinAAgroup.TreatmentwithTFB67,133

-1

mg?

kgcouldincreasethebodyweightgain,weakenAAratssecondarypalmswelling

and