整理冰冻切片实验步骤Word下载.docx

1、C 预冷的丙酮固定 10min，2. PBS（PH 为 7.2-7.4）在 9cm 皿内摇床冲洗 3 次，每次 5min（第一次冲洗时间短些，约1min 后更换）3. 用 3%过氧化氢一份，纯甲醇 50 份（需要现配，避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿）30min。4. PBS（PH 为 7.2-7.4，酸性）在 9cm 皿内摇床冲洗 3 次，每次 5min（第一次冲洗时间短些，约 1min 后更换），甩去 PBS，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周围画一适当大小的圈，距离组织不宜太近，与切片组织保持 5mm 左右距离，太近会导致边缘效应。5. 5%BSA，室温孵育 20min，期间注

2、意观察，以免 BSA 干燥而导致背景太高，请注意在皿内玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。6. 甩去血清，PBS 洗 1min，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓度不均。7. 配置一抗工作液用 5%BSA（抗体浓度为 1:100），悬空加入一抗工作液 50-100ul，枪头不要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗， 否则抗体可能附着不匀。8. 放入湿盒内，置于 4C 冰箱过夜（最长不可超过 48h），注意盖盖，放入后观察玻片是否处于水平位（否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，出现背景高和假阳性），孵育期间观察抗体是否干，若干了赶快用 PBS 清

3、洗浸泡。9. 第二天上午取出玻片，置常温复温 30min，后 PBS 冲洗 1+5+5+5min，10. 滴加 1:100 生物素标记的二抗（注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在 EP 管内弹匀，掌上离心机离心）室温孵育 30min-1h，后 PBS 冲洗 1+5+5+5min。11. 滴加 1:100 比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素 PBS 稀释液（SABC）室温1h，后 PBS 冲洗 1+5+5+5min，甩干，以免显色不均。12. DAB 显色，显色时放置在白色纸上，观察显色程度以终止 DAB 反应，最好把玻片置于显微镜上找到可能的阳性显色区域滴加 DAB，观察到阳性区和阴性

4、区差异后终止，此时最好有计时，以便于今后重复试验控制显色时间（一般显色时间 2s-10min，显色时间过长背景高，且可靠性低）13. 终止 DAB 显色可将玻片置于染色缸内，用自来水流水稀释终止 5min，后在显微镜下观察是否有 DAB 颗粒附着。14. 甩干水分，苏木素复染（如为加汞的苏木素，显色时间为 6-10s，可不用酒精分化，直接用 PBS 返蓝，如为非加汞苏木素，需在盐酸酒精分化），苏木素终止亦可用自来水冲洗终止反应。15. 水洗后梯度酒精脱水二甲苯透明（75%-85%-95%-100%-100%-二甲苯 1-二甲苯 2）个3min，滴加中性树胶封片，中性树胶浓度以不拉丝为宜16.

5、封片后干燥 1h（或者在通风橱吹风的情况下 15min），用棉球沾湿二甲苯擦去溢出的树胶。观察照相。针对脱片问题，我做了如下处理。但仍存在脱片现象，麻烦您给我提一些相关的建议。自来水冲洗玻片，晾干后，多聚赖氨酸的涂胶以下两种方法我都试过1. 单涂胶：往一张玻片上加0.01%的多聚赖氨酸80ul，用另一张玻片推片，然后叠加其上，停留5分钟，中间推动玻片数次，使液体涂抹均匀，分开两张玻片，滤纸吸干玻片下缘，置玻片架上600C烤干1h备用。2. 双涂胶：往一张玻片上加0.01%多聚赖氨酸80ul,单涂胶600C烤干,同样方法重复涂胶1次600C烤干,备用。我用过的尼氏染色的方法，效果不错。1. 溶液

6、配制：（1） 溶液 A：焦油固紫 0.2g, 纯水 500ml（2） 溶液 B：0.1M 冰醋酸 冰醋酸 3ml， 纯水 500ml（3） 溶液 C：0.1M 无水醋酸钠 无水醋酸钠 4.1g，纯水 500ml（4） 溶液 D：PH3.54.5 醋酸缓冲液 B 液 94mlC 液 6ml（5） 工作液：A 液 10mlD 液 90ml 过滤后使用，避光保存注：焦油固紫遇光分解，整个过程应避光操作，可以用黑色塑料袋罩着。2. 具体步骤： 如果为石蜡切片，先进行脱蜡处理，然后从步骤开始；如果为冰冻切片，从步骤开始。 将凉干的切片放入纯水中 35min。 切片放入焦油固紫染色液中 11.5h。 切片

7、放入纯水中洗去浮色。 切片放入 708095的酒精分色，各几秒钟，时间自己掌握，以不见掉色为好。 切片放入特殊分色液中褪背底（1：1：1 的无水乙醇，氯仿，乙醚）。 切片放入 100乙醇，5min3 次；二甲苯 5min3 次，透明封固。整个过程要保证切片不能干掉。3、结果尼氏小体：深蓝紫色；核、核仁：浅紫色；背底：洁白无色。我个人觉得特殊分色液挺重要的Highman 甲醇刚果红染色法（类淀粉染色）1、试剂配制：甲醇刚果红染液: 刚果红 0.5 g 甲醇 80 ml 甘油 20 ml碱性乙醇分化液: 氢氧化钾 0.2 g 80%乙醇 100 ml2、染色步骤:（1） 切片脱蜡至水（2） 甲醇刚

8、果红染液染 1020 分钟（3） 用碱性乙醇分化液分化数秒（4） 水洗（5） 苏木素复染 2 分钟（6） 水洗（7） 脱水,透明,封固3、结果：淀粉样物呈桔红色。4、类淀粉染色的应用：确定淀粉样变性及玻璃样变性的胶原组织，后者在刚果红法染色后呈淡桔色，冰冻切片脱脂问题：0.5 盐酸乙醇分化液 配置直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。试剂与仪器l 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.

9、01mol/L，pH7.4l 荧光标记的抗体溶液：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 进行稀释l 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制l 搪瓷桶三只（内有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml）l 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）l 荧光显微镜l 玻片架l 滤纸l 37温箱等。实验步骤1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 于待检标本片上，10min 后弃去，使标本保持一定湿度。2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。3.

10、 取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 冲洗后，再按顺序过 0.01mol/L，pH7.4 的PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（+）荧光明亮；（+ -+）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“+”以上，而各种对照显示为（）或（-），即可判定为阳性。注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不

11、应超过 1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从 10 min 到数小时，一般30 min 已足够。染色温度多采用室温（25左右），高于 37可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用 0-2的低温，延长染色时间。低温染色过夜较 3730 min 效果好的多。3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。（1） 标本自发荧光对照：标本加 1-2 滴 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS。（2） 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记

12、的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。（3） 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。4. 一般标本在高压汞灯下照射超过 3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。免疫荧光的标本制作的基本程序同 DAB 显色的免疫组化： 不同的是1 免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其它相同2 免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定3 二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察4、免疫荧光在封片使用专用封

13、片剂或甘油：0.01MPBS （1：1）5 条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中，标本可以保存更久6 荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光87 荧光抗体染色假阳性可能会多，需要设定阳性和阴性对照1. 荧光染色后一般在 1h 内完成观察，或于 4保存 4h，时间过长 ，会使荧光减弱。2. 每次试验时 ，需设置以下三种对照：（1） 阳性对照：阳性血清+荧光标记物（2） 阴性对照：阴性血清+荧光标记物（3） 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物免疫荧光组织（细胞）化学技术：如何设置对照（直接法、间接法和补体法）cyh（2010-07-28 11:23:08）为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性，排除

14、某些非特异性染色，必须在初次试验时设置对照：1、直接法（1） 标本自发荧光对照标本只加 PBS 或缓冲甘油封片，荧光显微镜观察组织内如果有荧光，称为自发荧光。（2） 抑制试验可分为一步方法和二步方法。一步抑制方法：先将荧光抗体与过量未标记特异性抗体作等量混合，再加在标本上染色，结果应为阴性。二步抑制方法：标本先加未标记的特异性抗体，水洗后再加标记荧光抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。（3） 阳性对照用已知阳性标本做直接法免疫荧光组织化学染色，结果应呈阳性荧光。如对照 1和 2 无荧光或弱荧光，3 待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。2、间接法（1） 自发荧光对照：同直接法。（2） 荧光抗体

15、对照：标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。（3） 抑制试验：（4） 阳性对照：结果：如对照（1）、（2）、（3）均呈阴性，阳性对照和待检标本呈阳性荧光则为特异性荧光。3、补体法（1） 自发荧光对照（2） 荧光抗体对照（3） 抑制试验（4） 补体对照：取新鲜豚鼠血清 1:10 稀释，先作用于标本，洗后再用抗补体荧光抗体染色，结果阴性。（5） 抑制试验：标本加灭活的第一抗体，再加 1:10 稀释的新鲜豚鼠血清孵育后， 再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀释液，结果应为阴性。（6） 阳性对照。（1）（5）结果阴性，（6）待检标本阳性时，则为特异性荧光。石家庄市第一医院编号：GZZD-YL

16、TY-06版次：A/1各类外科手术分类生效日期：2006-12-10页码：第9页 共12 页外科系统甲类手术1 普通外科1.1 全胃切除术、胃癌扩大根治术1.2 左右半肝切除术、肝左外侧叶切除及楔形切除1.3 胰腺癌根治术、扩大胰头十二指肠切除术1.4 胆道再次手术1.5 腹主动脉瘤切除、移植术1.6 带血管胎儿胰腺移植术1.7 经胸颈无名及锁骨下动脉瘤切除术、血管移植术1.8 扩大全胰腺切除术1.9 甲状腺癌颈淋巴结廓清术、甲状旁腺切除术1.10 右心耳下腔静脉旁路移植术1.11 腹腔内肿瘤联合 3 种以上脏器切除术1.12 新开展的各种手术1.13 诊断不明确的探查术2 心胸外科2.1 “

17、法四”、“法三”矫治术2.2 伴肺动脉高压的房室缺修补术2.3 主动脉缩窄、腹主动脉瘤血管再造术2.4 心脏多瓣膜置换及成形术2.5 冠状动脉架桥数2.6 复杂的心内畸形及矫治术2.7 主动脉瘤切除术2.8 纵隔瘤切除术2.9 新开展的各种手术2.10 诊断不明确的探查术第21页 共12 页3 神经外科3.1 经幕上下入路各种肿瘤切除术3.2 经幕上下入路各类动脉瘤夹闭术3.3 经幕上下入路畸形血管切除术3.4 自体异体肾上腺髓质或黑质脑内移植术3.5 新开展的各种手术4 泌尿外科4.1 肾血管手术4.2 肾移植术4.3 颈皮肾镜取石术4.4 肾上腺手术4.5 新开展的各种手术4.6 诊断不明

18、确的探查术5 烧伤整形外科5.1 异体皮开窗、自体皮嵌入术5.2 血管移植、皮瓣覆盖术5.3 吻合血管、游离皮瓣移植术、异体大网膜移植术5.4 静脉网状皮岛5.5 微移字体皮、大张异体皮混合移植术5.6 新开展的各种手术5.7 诊断不明确的探查术6 骨伤科6.1 全关节人工关节置换术6.2 血管蒂指（趾）再造术6.3 断肢指（趾）再造术乙类手术1.1 甲类手术以外的肝、胆、胰、脾手术1.2 胃部及十二指肠手术、胃肠吻合术1.3 肝脾损伤的处理1.4 直肠切除术、回盲部切除术1.5 结肠造口术、各断结肠癌根治术1.6 甲类手术以外的甲状腺、甲状旁腺各种手术1.7 乳癌根治术1.8 门静脉高压的各

19、种分流术及断流术1.9 各断肠癌根治术1.10 腹部损伤剖腹探查术2.1 心包部分切除术2.2 房室缺损修补术2.3 心脏单瓣置换术、扩张分离术及成形术2.4 动脉导管未闭手术2.5 心脏大血管造影诊断2.6 全肺及肺叶切除术2.7 胸膜切除术2.8 除甲类以外的纵隔手术2.9 气管支气管形成术2.10 人工心脏起搏器置入术2.11 人造血管移植术2.12 颈及胸上段食管癌切除术2.13 颈部血管瘤切除术2.14 结肠代食管术2.15 除甲类以外的胸腔探查术3.1 除甲类以外各种颅内手术3.2 椎管内外各种手术3.3 各种神经吻合术3.4 开放型颅脑损伤清除术3.5 各类颅骨手术3.6 各类经

20、颅骨钻孔减压、引流、抽吸手术3.7 经股动脉插管全脑血管造影术3.8 经颅动脉穿刺脑血管造影术4.1 除甲类以外的肾脏手术4.2 输尿管手术4.3 膀胱手术4.4 泌尿系（尿道以上）造口、修补、成形手术4.5 前列腺摘除术4.6 阴囊、阴茎手术5.1 血管植入皮瓣预构手术5.2 切（削）痂、植皮术5.3 皮瓣移植术5.4 皮管成形术5.5 游离肌皮瓣移植术6.1 脊柱侧弯矫形术6.2 严重创伤全身合并综合征的处理6.3 关节融合术6.4 先天性髋脱位手术6.5 截肢（指、趾）术、半月板切除术6.6 骨肿瘤切除术6.7 骨疣切除术6.8 三翼钉固定拔钉术6.9 四肢骨内固定及植骨、钢板取出术6.

21、10 各类关节手术6.11 开放性骨折扩创复位术6.12 皮管成形术修整丙类手术1. 普通外科1.1 肝脓肿切开引流术1.2 肠切除术1.3 腹部损伤剖腹探查术1.4 胃肠穿孔修补术1.5 胃肠造口术、吻合术1.6 大隐静脉结扎转流术及剔除术1.7 胆囊单纯造口术1.8 乳腺单纯切除术2. 心胸外科2.1 胸壁软组织良性瘤切除术2.2 胸腔闭式引流术2.3 脓腔开放引流术2.4 胸壁结核病灶清除术3.1 各种复杂头皮外伤清创缝合术3.2 各种头皮肿瘤切除术3.3 各种外生骨疣切除术3.4 经动脉穿刺化疗术4.1 单纯尿道手术4.2 除乙类手术外的前列腺其他手术5 骨科手术5.1 肌腱移位术5.

22、2 手部腱鞘囊肿切除术5.3 拇指外翻矫形术5.4 闭和性骨折复位固定术5.5 低毒性骨脓肿病灶清除术5.6 骨牵引术丁类手术1.1 一次性阑尾手术1.2 一次性疝修补术1.3 体表肿瘤异物摘除术1.4 痔核 痔漏手术1.5 体表脓肿切开引流术2.1 纵隔气肿切开减压术2.2 胸壁伤口清创缝合术3.1 各种轻度头皮外伤缝合术4.1 单纯包皮环切及外伤缝合4.2 单纯前列腺手术5 骨伤科5.1 小关节脱位手法复位5.2 小关节腔切开引流妇产科系统甲类手术1 子宫癌根治术2 卵巢癌根治术3 复杂尿漏修补术4 外阴癌根治术5 各种疑难阴式手术6 各种人工阴道成形术7 各种难产的复杂手术8 新开展的各

23、种手术9 诊断不明的探查术乙类手术1 除甲类手术以外的子宫 宫颈手术2 除甲类手术以外的附件移位 整形 切除术3 外阴广泛切除术4 简单阴道 尿道修补术，单纯外阴切除术5 碎胎术 穿颅术6 腹膜外剖宫产术7 阔韧带手术8度会阴裂伤缝合术丙类手术1 除甲类手术以外的附件手术2 除甲类手术以外的外阴手术3 古典式剖宫产手术 子宫下段剖宫产手术4 宫外孕手术5度会阴裂伤缝合术丁类手术1 宫颈活检2 上环、取环、人工流产术3 胎头吸引术4 人工取胎盘5 臀牵引术6 巴氏腺囊肿切开术7 处女膜切开术8度以下会阴裂伤缝合术9 会阴侧切术10 各种电凝术眼科手术1 光学角膜移植术2 眼眶深部异物取出术3 玻

24、璃体切割术4 人工晶体植入术5 眶内肿瘤摘除术6 眶内容剜除术7 复杂网膜脱离术8 新开展的各种手术乙类手术1 眼眶再造术2 白内障囊外摘除术3 放射状板层角膜切开术4 眼肌手术5 青光眼、白内障手术6 眼眶成形术7 眼睑成形术8 玻璃体手术9 除甲类以外的晶体手术10 除甲类以外的眶内手术11 除甲类以外的网膜手术12 除甲类以外的眼球手术13 泪囊鼻腔吻合术丙类手术1 除乙类以外的眼睑手术2 除乙类以外的结膜、角膜手术3 简单眼外伤 耳鼻咽喉科系统1 喉癌根治术2 半喉切除术及发音重建术3 喉成形术4 鼻成形术5 内耳手术6 乳突根治术7 经开颅途径巨大额筛窦肿瘤切除术8 鼻咽癌手术乙类手术1 上颌骨切除术2 气管食管异物取出3 除甲类以外喉部手术4 骨膜修补术5 面神经减压术6 外耳道狭窄闭锁整复术7 耳廓成形术8 蝶窦、筛窦手术9 鼻中隔手术10 除甲类以外乳突手术11 上颌窦根治术丙类手术1 扁桃体摘除术2 腺样体刮除术3 中下鼻甲部分切除术4 鼻甲封闭与电凝丁类