整理冰冻切片实验步骤Word下载.docx

整理冰冻切片实验步骤Word下载.docx

《整理冰冻切片实验步骤Word下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《整理冰冻切片实验步骤Word下载.docx（21页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

C预冷的丙酮固定10min，

2.PBS（PH为7.2-7.4）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约

1min后更换）

3.用3%过氧化氢一份，纯甲醇50份（需要现配，避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿）

30min。

4.PBS（PH为7.2-7.4，酸性）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换），甩去PBS，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周

围画一适当大小的圈，距离组织不宜太近，与切片组织保持5mm左右距离，太近会导

致边缘效应。

5.5%BSA，室温孵育20min，期间注意观察，以免BSA干燥而导致背景太高，请注意在皿内玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。

6.甩去血清，PBS洗1min，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓度不均。

7.配置一抗工作液用5%BSA（抗体浓度为1:

100），悬空加入一抗工作液50-100ul，枪头

不要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否则抗体可能附着不匀。

8.放入湿盒内，置于4°

C冰箱过夜（最长不可超过48h），注意盖盖，放入后观察玻片是否处于水平位（否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，出现背景高和假阳性），孵育期间观察抗体是否干，若干了赶快用PBS清洗浸泡。

9.第二天上午取出玻片，置常温复温30min，后PBS冲洗1+5+5+5min，

10.滴加1:

100生物素标记的二抗（注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在EP管内弹

匀，掌上离心机离心）室温孵育30min-1h，后PBS冲洗1+5+5+5min。

11.滴加1:

100比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素PBS稀释液（SABC）室温

1h，后PBS冲洗1+5+5+5min，甩干，以免显色不均。

12.DAB显色，显色时放置在白色纸上，观察显色程度以终止DAB反应，最好把玻片置于显微镜上找到可能的阳性显色区域滴加DAB，观察到阳性区和阴性区差异后终止，此时最好有计时，以便于今后重复试验控制显色时间（一般显色时间2s-10min，显色时间过长背景高，且可靠性低）

13.终止DAB显色可将玻片置于染色缸内，用自来水流水稀释终止5min，后在显微镜下观

察是否有DAB颗粒附着。

14.甩干水分，苏木素复染（如为加汞的苏木素，显色时间为6-10s，可不用酒精分化，直接用PBS返蓝，如为非加汞苏木素，需在盐酸酒精分化），苏木素终止亦可用自来水冲洗终止反应。

15.水洗后梯度酒精脱水二甲苯透明（75%-85%-95%-100%-100%-二甲苯1-二甲苯2）个

3min，滴加中性树胶封片，中性树胶浓度以不拉丝为宜

16.封片后干燥1h（或者在通风橱吹风的情况下15min），用棉球沾湿二甲苯擦去溢出的树胶。

观察照相。

针对脱片问题，我做了如下处理。

但仍存在脱片现象，麻烦您给我提一些相关的建议。

自来水冲洗玻片，晾干后，多聚赖氨酸的涂胶以下两种方法我都试过

1.单涂胶：

往一张玻片上加0.01%的多聚赖氨酸80ul，用另一张玻片推片，然后叠加其上，停留5分钟，中间推动玻片数次，使液体涂抹均匀，分开两张玻片，滤纸吸干玻片下缘，置玻片架上600C烤干1h备用。

2.双涂胶：

往一张玻片上加0.01%多聚赖氨酸80ul,单涂胶600C烤干,同样方法重

复涂胶1次"

600C烤干,备用。

我用过的尼氏染色的方法，效果不错。

1.溶液配制：

（1）溶液A：

焦油固紫0.2g,纯水500ml

（2）溶液B：

0.1M冰醋酸冰醋酸3ml，纯水500ml

（3）溶液C：

0.1M无水醋酸钠无水醋酸钠4.1g，纯水500ml

（4）溶液D：

PH3.5~4.5醋酸缓冲液B液94ml＋C液6ml

（5）工作液：

A液10ml＋D液90ml过滤后使用，避光保存

注：

焦油固紫遇光分解，整个过程应避光操作，可以用黑色塑料袋罩着。

2.具体步骤：

⑴如果为石蜡切片，先进行脱蜡处理，然后从步骤⑵开始；

如果为冰冻切片，从步骤⑵开始。

⑵将凉干的切片放入纯水中3～5min。

⑶切片放入焦油固紫染色液中1～1.5h。

⑷切片放入纯水中洗去浮色。

⑸切片放入70％－80％－95％的酒精分色，各几秒钟，时间自己掌握，以不见掉色为好。

⑹切片放入特殊分色液中褪背底（1：

1：

1的无水乙醇，氯仿，乙醚）。

⑺切片放入100％乙醇，5min×

3次；

二甲苯5min×

3次，透明封固。

整个过程要保证切片不能干掉。

3、结果

尼氏小体：

深蓝紫色；

核、核仁：

浅紫色；

背底：

洁白无色。

我个人觉得特殊分色液挺重要的

Highman甲醇刚果红染色法（类淀粉染色）

1、试剂配制：

甲醇刚果红染液:

刚果红0.5g甲醇80ml甘油20ml

碱性乙醇分化液:

氢氧化钾0.2g80%乙醇100ml

2、染色步骤:

（1）切片脱蜡至水

（2）甲醇刚果红染液染10～20分钟

（3）用碱性乙醇分化液分化数秒

（4）水洗

（5）苏木素复染2分钟

（6）水洗

（7）脱水,透明,封固

3、结果：

淀粉样物呈桔红色。

4、类淀粉染色的应用：

确定淀粉样变性及玻璃样变性的胶原组织，后者在刚果红法染色后呈淡桔色，

冰冻切片脱脂问题：

0.5盐酸乙醇分化液配置

直接免疫荧光法测抗原基本原理

将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。

其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光

染色少。

缺点是敏感性偏低；

而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。

此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。

试剂与仪器

l磷酸盐缓冲盐水（PBS）：

0.01mol/L，pH7.4

l荧光标记的抗体溶液：

以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释

l缓冲甘油：

分析纯无荧光的甘油9份+pH9.20.2M碳酸盐缓冲液1份配制

l搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS1500ml）

l有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）

l荧光显微镜

l玻片架

l滤纸

l37℃温箱等。

实验步骤

1.滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。

2.滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：

30min）。

3.取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的

PBS三缸浸泡，每缸3-5min，不时振荡。

4.取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。

5.立即用荧光显微镜观察。

观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：

（-）无荧光；

（±

）极弱的可疑荧光；

（+）荧光较弱，但清楚可见；

（++）荧光明亮；

（+++--

++++）荧光闪亮。

待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±

）或（-），即可判定为阳性。

注意事项

1.对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：

20，抗体浓度

过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。

2.染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10min到数小时，一般30min已足够。

染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。

低温染色过夜较37℃30min效果好的多。

3.为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。

（1）标本自发荧光对照：

标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。

（2）特异性对照（抑制试验）：

标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。

（3）阳性对照：

已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。

如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。

4.一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。

免疫荧光的标本制作的基本程序同DAB显色的免疫组化：

不同的是

1免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其它相同

2免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定

3二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察

4、免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油：

0.01MPBS（1：

1）

5条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中，标本可以保存更久

6荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光

87荧光抗体染色假阳性可能会多，需要设定阳性和阴性对照

1.荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。

2.每次试验时，需设置以下三种对照：

（1）阳性对照：

阳性血清+荧光标记物

（2）阴性对照：

阴性血清+荧光标记物

（3）荧光标记物对照：

PBS+荧光标记物

免疫荧光组织（细胞）化学技术：

如何设置对照（直接法、间接法和补体法）

cyh（2010-07-2811:

23:

08）

为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次试验时设置对照：

1、直接法

（1）标本自发荧光对照

标本只加PBS或缓冲甘油封片，荧光显微镜观察组织内如果有荧光，称为自发荧

光。

（2）抑制试验

可分为一步方法和二步方法。

一步抑制方法：

先将荧光抗体与过量未标记特异性抗体作等量混合，再加在标本上染色，结果应为阴性。

二步抑制方法：

标本先加未标记的特异性抗体，水洗后再加标记荧光抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。

（3）阳性对照

用已知阳性标本做直接法免疫荧光组织化学染色，结果应呈阳性荧光。

如对照1

和2无荧光或弱荧光，3待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。

2、间接法

（1）自发荧光对照：

同直接法。

（2）荧光抗体对照：

标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。

（3）抑制试验：

（4）阳性对照：

结果：

如对照

（1）、

（2）、（3）均呈阴性，阳性对照和待检标本呈阳性荧光则为特异性荧光。

3、补体法

（1）自发荧光对照

（2）荧光抗体对照

（3）抑制试验

（4）补体对照：

取新鲜豚鼠血清1:

10稀释，先作用于标本，洗后再用抗补体荧光抗体染色，结果阴性。

（5）抑制试验：

标本加灭活的第一抗体，再加1:

10稀释的新鲜豚鼠血清孵育后，再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀释液，结果应为阴性。

（6）阳性对照。

（1）~（5）结果阴性，（6）待检标本阳性时，则为特异性荧光。

石家庄市第一医院

编号：

GZZD-YLTY-06

版次：

A/1

各类外科手术分类

生效日期：

2006-12-10

页码：

第 9 页共 12页

外科系统甲类手术

1普通外科

1.1全胃切除术、胃癌扩大根治术

1.2左右半肝切除术、肝左外侧叶切除及楔形切除

1.3胰腺癌根治术、扩大胰头十二指肠切除术

1.4胆道再次手术

1.5腹主动脉瘤切除、移植术

1.6带血管胎儿胰腺移植术

1.7经胸颈无名及锁骨下动脉瘤切除术、血管移植术

1.8扩大全胰腺切除术

1.9甲状腺癌颈淋巴结廓清术、甲状旁腺切除术

1.10右心耳下腔静脉旁路移植术

1.11腹腔内肿瘤联合3种以上脏器切除术

1.12新开展的各种手术

1.13诊断不明确的探查术

2心胸外科

2.1“法四”、“法三”矫治术

2.2伴肺动脉高压的房室缺修补术

2.3主动脉缩窄、腹主动脉瘤血管再造术

2.4心脏多瓣膜置换及成形术

2.5冠状动脉架桥数

2.6复杂的心内畸形及矫治术

2.7主动脉瘤切除术

2.8纵隔瘤切除术

2.9新开展的各种手术

2.10诊断不明确的探查术

第 21 页共 12页

3神经外科

3.1经幕上下入路各种肿瘤切除术

3.2经幕上下入路各类动脉瘤夹闭术

3.3经幕上下入路畸形血管切除术

3.4自体异体肾上腺髓质或黑质脑内移植术

3.5新开展的各种手术

4泌尿外科

4.1肾血管手术

4.2肾移植术

4.3颈皮肾镜取石术

4.4肾上腺手术

4.5新开展的各种手术

4.6诊断不明确的探查术

5烧伤整形外科

5.1异体皮开窗、自体皮嵌入术

5.2血管移植、皮瓣覆盖术

5.3吻合血管、游离皮瓣移植术、异体大网膜移植术

5.4静脉网状皮岛

5.5微移字体皮、大张异体皮混合移植术

5.6新开展的各种手术

5.7诊断不明确的探查术

6骨伤科

6.1全关节人工关节置换术

6.2血管蒂指（趾）再造术

6.3断肢指（趾）再造术乙类手术

1.1甲类手术以外的肝、胆、胰、脾手术

1.2胃部及十二指肠手术、胃肠吻合术

1.3肝脾损伤的处理

1.4直肠切除术、回盲部切除术

1.5结肠造口术、各断结肠癌根治术

1.6甲类手术以外的甲状腺、甲状旁腺各种手术

1.7乳癌根治术

1.8门静脉高压的各种分流术及断流术

1.9各断肠癌根治术

1.10腹部损伤剖腹探查术

2.1心包部分切除术

2.2房室缺损修补术

2.3心脏单瓣置换术、扩张分离术及成形术

2.4动脉导管未闭手术

2.5心脏大血管造影诊断

2.6全肺及肺叶切除术

2.7胸膜切除术

2.8除甲类以外的纵隔手术

2.9气管支气管形成术

2.10人工心脏起搏器置入术

2.11人造血管移植术

2.12颈及胸上段食管癌切除术

2.13颈部血管瘤切除术

2.14结肠代食管术

2.15除甲类以外的胸腔探查术

3.1除甲类以外各种颅内手术

3.2椎管内外各种手术

3.3各种神经吻合术

3.4开放型颅脑损伤清除术

3.5各类颅骨手术

3.6各类经颅骨钻孔减压、引流、抽吸手术

3.7经股动脉插管全脑血管造影术

3.8经颅动脉穿刺脑血管造影术

4.1除甲类以外的肾脏手术

4.2输尿管手术

4.3膀胱手术

4.4泌尿系（尿道以上）造口、修补、成形手术

4.5前列腺摘除术

4.6阴囊、阴茎手术

5.1血管植入皮瓣预构手术

5.2切（削）痂、植皮术

5.3皮瓣移植术

5.4皮管成形术

5.5游离肌皮瓣移植术

6.1脊柱侧弯矫形术

6.2严重创伤全身合并综合征的处理

6.3关节融合术

6.4先天性髋脱位手术

6.5截肢（指、趾）术、半月板切除术

6.6骨肿瘤切除术

6.7骨疣切除术

6.8三翼钉固定拔钉术

6.9四肢骨内固定及植骨、钢板取出术

6.10各类关节手术

6.11开放性骨折扩创复位术

6.12皮管成形术修整丙类手术

1.普通外科

1.1肝脓肿切开引流术

1.2肠切除术

1.3腹部损伤剖腹探查术

1.4胃肠穿孔修补术

1.5胃肠造口术、吻合术

1.6大隐静脉结扎转流术及剔除术

1.7胆囊单纯造口术

1.8乳腺单纯切除术

2.心胸外科

2.1胸壁软组织良性瘤切除术

2.2胸腔闭式引流术

2.3脓腔开放引流术

2.4胸壁结核病灶清除术

3.1各种复杂头皮外伤清创缝合术

3.2各种头皮肿瘤切除术

3.3各种外生骨疣切除术

3.4经动脉穿刺化疗术

4.1单纯尿道手术

4.2除乙类手术外的前列腺其他手术

5骨科手术

5.1肌腱移位术

5.2手部腱鞘囊肿切除术

5.3拇指外翻矫形术

5.4闭和性骨折复位固定术

5.5低毒性骨脓肿病灶清除术

5.6骨牵引术丁类手术

1.1一次性阑尾手术

1.2一次性疝修补术

1.3体表肿瘤异物摘除术

1.4痔核痔漏手术

1.5体表脓肿切开引流术

2.1纵隔气肿切开减压术

2.2胸壁伤口清创缝合术

3.1各种轻度头皮外伤缝合术

4.1单纯包皮环切及外伤缝合

4.2单纯前列腺手术

5骨伤科

5.1小关节脱位手法复位

5.2小关节腔切开引流妇产科系统

甲类手术

1子宫癌根治术

2卵巢癌根治术

3复杂尿漏修补术

4外阴癌根治术

5各种疑难阴式手术

6各种人工阴道成形术

7各种难产的复杂手术

8新开展的各种手术

9诊断不明的探查术乙类手术

1除甲类手术以外的子宫宫颈手术

2除甲类手术以外的附件移位整形切除术

3外阴广泛切除术

4简单阴道尿道修补术，单纯外阴切除术

5碎胎术穿颅术

6腹膜外剖宫产术

7阔韧带手术

8Ⅲ度会阴裂伤缝合术丙类手术

1除甲类手术以外的附件手术

2除甲类手术以外的外阴手术

3古典式剖宫产手术子宫下段剖宫产手术

4宫外孕手术

5Ⅱ度会阴裂伤缝合术

丁类手术

1宫颈活检

2上环、取环、人工流产术

3胎头吸引术

4人工取胎盘

5臀牵引术

6巴氏腺囊肿切开术

7处女膜切开术

8Ⅱ度以下会阴裂伤缝合术

9会阴侧切术

10各种电凝术眼科手术

1光学角膜移植术

2眼眶深部异物取出术

3玻璃体切割术

4人工晶体植入术

5眶内肿瘤摘除术

6眶内容剜除术

7复杂网膜脱离术

8新开展的各种手术乙类手术

1眼眶再造术

2白内障囊外摘除术

3放射状板层角膜切开术

4眼肌手术

5青光眼、白内障手术

6眼眶成形术

7眼睑成形术

8玻璃体手术

9除甲类以外的晶体手术

10除甲类以外的眶内手术

11除甲类以外的网膜手术

12除甲类以外的眼球手术

13泪囊鼻腔吻合术丙类手术

1除乙类以外的眼睑手术

2除乙类以外的结膜、角膜手术

3简单眼外伤耳鼻咽喉科系统

1喉癌根治术

2半喉切除术及发音重建术

3喉成形术

4鼻成形术

5内耳手术

6乳突根治术

7经开颅途径巨大额筛窦肿瘤切除术

8鼻咽癌手术乙类手术

1上颌骨切除术

2气管食管异物取出

3除甲类以外喉部手术

4骨膜修补术

5面神经减压术

6外耳道狭窄闭锁整复术

7耳廓成形术

8蝶窦、筛窦手术

9鼻中隔手术

10除甲类以外乳突手术

11上颌窦根治术丙类手术

1扁桃体摘除术

2腺样体刮除术

3中下鼻甲部分切除术

4鼻甲封闭与电凝丁类