生化提取实验讲义.docx

1、生化提取实验讲义生 化 制 药 技 术威海职业学院生物与化学工程系二0一一年二月前言1项目一 L-胱氨酸的制备与鉴定2项目二 溶菌酶的制备4项目三 卵磷脂的制备及鉴定6项目四 甘露醇的制备及鉴定7项目五 芦丁的提取与鉴定9参考文献 11前 言生化制药技术是生化制药技术专业的专业核心课程之一，生化制药技术实验实训指导书是本课程的重要组成部分。根据该课程教学大纲的规定，学生在掌握一定生化药品制备技术理论知识的基础上，必须通过实验实训学习，掌握生化药品制备常用的提取、分离、精制、干燥等方法和实验操作技术，培养学生科学认真的工作态度和熟练的基本操作技能。本实验实训指导书的编写，主要参照生化制药技术、现

2、代生物制药工艺学、天然植物化学等参考资料所收载的部分内容，结合本专业实训基地现有的实验实训条件，从中选出较为典型的生化药品实例的制备方法，供学生实验学习使用。实验设计包括氨基酸、蛋白质、酶、脂及多糖类等，生化药品制备与鉴定基本操作技术，以培养学生进行生化药品的生产制造与鉴别的能力。为了完成本课程实验实训教学大纲的学习内容，要求学生实验实训课前，必须认真预习，明确实验目的，熟悉实验内容和方法，并结合课堂教学，理解实验的基本原理；实验中必须有严谨的科学态度和实事求是的工作作风；严格操作，正确使用仪器，认真观察实验现象，详细、真实地做好实验原始记录；实验报告要求书写正确规范；严格遵守实验室规章制度，

3、注意安全，保持室内卫生。本实验实训指导书由李顺康、高英霞、殷永新、肖凤华、元超老师编写完成，主要供生化制药技术实验实训的学生参考。由于编者按水平有限，加之时间仓促，如有不当之处，恳请读者批评指正。 编者项目一 L-胱氨酸的制备及鉴定一、实验目的要求1、熟悉用人发制备氨基酸类药物的原理。2、掌握水解法制备氨基酸的方法。二、实验重点和难点L-胱氨酸的制备与精制方法。三、实验原理蛋白质由一定数量的氨基酸经过特定的排列方式组合而成的。因此，在一定条件下将蛋白质水解可得到各种氨基酸的混合液，再经过进一步的提取、精制，即可得到所需的氨基酸。本实验是用已洗净并干燥的人发，先用酸水解，然后调节pH至胱氨酸等当

4、点（5.05左右）时，胱氨酸从水解液中沉淀出来，经精制得到其结晶。四、实验仪器、试剂与材料1、仪器：500ml短颈圆底烧瓶、冷凝管、电热套、玻璃漏斗、玻璃棒、抽滤瓶、布氏漏斗、恒温水浴锅、真空泵、表面皿、烧杯、滤纸。2、试液：（1）10mol/L盐酸溶液：取盐酸90ml加水稀释至100ml，摇匀，即得。（2）6%盐酸溶液：取盐酸6ml加水稀释至100ml，摇匀，即得。（3）10%氢氧化钠溶液：取氢氧化钠10g，加水溶解，放冷，加稀释至100ml，摇匀，即得。（4）25%氢氧化钠溶液：取氢氧化钠25g，加水溶解，放冷，加稀释至100ml，摇匀，即得。（5）10%氨水溶液：取氨10ml加水稀释至1

5、00ml，摇匀，即得。（6）2%硫酸铜溶液：取硫酸铜2g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀，即得。（7）0.1%EDTA溶液：取乙二胺四乙酸二钠0.1g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀，即得。（8）75%乙醇溶液：取无水乙醇75ml加水稀释至100ml，摇匀，即得。（9）0.5%茚三酮-丙酮溶液：取茚三酮0.5g，加丙酮溶解并稀释至100ml，摇匀，即得。3、试剂与材料：胱氨酸对照品、粉末活性炭、苯酚、盐酸、氢氧化钠、氨、硫酸铜、乙二胺四乙酸二钠、无水乙醇、95%乙醇、茚三酮、丙酮、人发。五、实验操作1、人发的处理：取无染色的人发，用碱性或中性洗涤剂洗净，用清水洗至水呈中性，晾干并剪短备用。

6、2、回流装置安装：在回流冷凝管上端接一弯玻璃管，下连一小漏斗用水封住，漏斗刚好接触水面，但不能伸到水中以免倒吸，避免氯化氢气体自仪器中逸出到空气中。3、水解：称取人发50g，置圆底烧瓶中，加10mol/L盐酸溶液100ml，加沸石或玻璃珠3粒，加热回流67小时，回流过程保持缓缓沸腾。水解完全后应不呈双缩脲反应，可停止反应，否则应继续水解至反应完全。4、双缩脲检查：取水解液3ml，加入少量粉末活性炭，在80水浴中脱色数分钟，过滤；向滤液中加10%氢氧化钠溶液3ml使呈碱性，然后沿管壁加2%硫酸铜溶液45滴，观察有无紫红色出现，若出现，水解未完全需继续水解。5、胱氨酸粗品制备：将水解液趁热过滤除去

7、残渣，滤液呈深棕色。当滤液温度降至60左右时在不断搅拌下，逐滴加入25%氢氧化钠溶液调pH至4.85.0，即产生胱氨酸沉淀。然后，置冷处过夜使沉淀完全，次日将沉淀置布氏漏斗中抽滤，并于5060干燥，得到胱氨酸粗品。6、结晶：称取胱氨酸粗品放入100ml烧杯中，加粗品4倍量4%盐酸溶液，加热至80左右，在不断搅拌下加约相当于胱氨酸粗品量15%的粉末活性炭，搅拌50分钟趁热抽滤。将滤液置于恒温水浴中加热至60不断搅拌下慢慢加25%氢氧化钠溶液，调pH至4.85.0，即有白色结晶迅速析出，放置56h后（在更长时间酪氨酸也可能与胱氨酸一同结晶出来）抽滤，得胱氨酸粗品。7、再次脱色并脱铁：取胱氨酸粗品放

8、入100ml烧杯中，加8倍粗品量6%盐酸溶液、5%粗品量粉末活性炭与0.1%EDTA溶液2ml，在80恒温水浴中搅拌30分钟，趁热减压抽滤。8、重结晶精制：将滤液置于60恒温水浴中，逐滴加10%氨溶液，调pH值至4.0（必须一滴一滴加，并不停的搅拌）左右，白色的胱氨酸结晶逐渐析出，放置过夜，抽滤，用少量纯化水洗涤结晶，再用75%乙醇洗涤，抽干。将胱氨酸纯品置表面皿上，于5060干燥，称重，计算产率。9、纯度鉴定：称取胱氨酸样品与对照品适量，配成相同浓度的溶液，用纸色谱法检查，以苯酚：水（7：3）为展开剂，以0.5%茚三酮-丙酮溶液为显色剂。在色谱图上应为单一斑点，Rf值应符合规定。六、结果与讨

9、论1、计算胱氨酸收率，讨论影响收率的因素。2、根据纸色谱结果分析所制备的胱氨酸纯度。项目二 溶菌酶的制备一、实验目的要求1、熟悉鸡蛋清制备溶菌酶的原理。2、掌握树脂吸附法、透析法及盐析法用于制备酶类药物的基本操作方法。二、实验重点和难点从蛋清中制备溶菌酶的工艺和操作方法。三、实验原理溶菌酶（EC3.2.1.17），又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基及芳香族氨基酸（如色氨酸）的比例很高。pH在l.211.3范围内剧烈变化时，其结构几乎不变，遇热也很稳定。在pH47，10O处理lmin仍保持原酶活性；pH5.5，5O加热4h后，酶变得更活泼；热变性

10、是可逆的，变性的临界点是77。随溶剂的变化变性临界点也有变化，当变性剂在pH1以下时，变性临界点降低到43。变性剂能促进酶的热变性，但变性剂过量时则酶的热变性变为不可逆。在碱性环境中用高温处理时，酶活性降低。十二烷基磺酸钠等对酶有抑制作用；滤纸也能抑制酶活性；氧化剂能使酶纯化；在6mol/L的盐酸胍溶液中酶完全变性；而在lOmol/L尿素中酶则不变性；用乙二醇、丙烯乙二醇、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、二氧杂环乙烷等有机溶剂进行变性实验，在5O以下时除乙醇、二氧杂环乙烷外，其他变性剂的浓度要在50%以上时才能使溶菌酶变性；氢氰酸能部分恢复酶活力。四、实验仪器、试剂与材料1、仪器：磁力搅拌器、电热套、

11、电炉、蒸馏装置、压片机、真空抽滤装置、透析袋、电动搅拌器、真空干燥箱。2、试液：（1）0.15mol/L磷酸缓冲液（pH6.5）：取磷酸二氢钾0.68g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液15.2ml，用水稀释至100ml，即得。（2）10%硫酸铵溶液：取硫酸铵10g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀，即得。（3）lmol/L氢氧化钠溶液：取氢氧化钠4g，加水溶解，放冷，加稀释至100ml，摇匀，即得。（4）3mol/L盐酸溶液：取盐酸27ml加水稀释至100ml，摇匀，即得。3、试剂与材料：乙醇、乙醚、无水硫酸钠、丙酮、磷酸、硫酸铵、氢氧化钠、氯化钠、淀粉、砂糖、滑石粉、鸡蛋、724树脂、漏斗、

12、滤纸、6080目筛子。五、操作步骤1、原料处理：新鲜蛋清250g，测pH为8左右，除去蛋清中的脐带、蛋壳碎片及其他杂质。2、吸附：温度降到5左右，在搅拌中加入处理好的724树脂50g（湿重）使树脂全部悬浮在蛋清中，在05搅拌吸附5h，再将蛋清在05静置过夜。3、去杂蛋白、洗脱、沉淀：渐渐倾出上清液，树脂用清水洗去吸附的蛋白质，反复洗4次，注意防止树脂流失，最后将树脂抽滤去水分。另取0.15mol/L磷酸缓冲液（pH6.5）15Oml分3次加入树脂中搅拌l5min，每次搅拌后减压抽滤去水分，再取10%硫酸铵溶液200m1，分4次洗脱溶菌酶，每次搅拌半小时，过滤抽干，合并洗脱液，按总体积加入32%

13、固体硫酸铵（质量体积比）使含量达到40%，有白色沉淀析出。冷处放置过夜虹吸上清液，沉淀离心分离或抽滤，得粗制品。4、透析：将粗制品加纯化水50ml使溶解，装入透析袋中在05透析2436h，除去大部分硫酸铵，得透析液。5、盐析：向澄清透析液中慢慢滴加lmol/L氢氧化钠溶液，随加随搅拌至pH值为8.59，如有白色沉淀应立即离心除去。然后在搅拌下加入3mol/L盐酸溶液使pH为3.5，按体积比缓缓加入5%固体氯化钠，即有白色沉淀析出。在0.5放置48h离心或过滤溶菌酶沉淀。6、干燥：沉淀加入10倍量冷至O的无水丙酮，不断搅拌使颗粒松散。冷处静置数小时，用漏斗滤去丙酮，沉淀用真空干燥直至无水丙酮脱水

14、，即得溶菌酶。7、制剂：取干燥砂糖粉，加入总量5%的滑石粉，通过120目筛；加5%淀粉，在搅拌机内搅拌均匀，制成软材，12目筛制粒；55烘干，用14目筛整颗粒，水分以控制在2%4%左右为宜；再按计算量加入溶菌酶粉混合，加1%硬脂酸镁，过16目筛2次，压制成溶菌酶口含片，每片含2Omg。六、注意事项1、注意原料的卫生，防止细菌污染变质，pH89，不要掺入蛋黄和其他杂质，避免影响收率和树脂对酶的吸附能力，操作的全过程要在低温（010）下进行，防止蛋清发酸、变质和酶失活。2、树脂再生、转型要彻底，提高收率。转为钠型后再用0.l5mol/L磷酸缓冲液（pH6.5）平衡过夜，平衡液的pH要保持在6.5。

15、用过的树脂可用饱和氢氧化钠及浓盐酸直接浸泡，再生和转型后，再用缓冲液平衡。3、溶菌酶的洗脱峰较宽，有拖尾现象，可用三氯乙酸检查洗脱液，如沉淀不明显应另行收集，用作下次洗脱用。4、透析液加碱去杂蛋白时，碱液应均匀加入，勿使局部浓度过高造成酶失活。七、结果与讨论1、称重，计算溶菌酶的收率。2、讨论影响溶菌酶收率的因素。3、分析提取溶菌酶所需要树脂的选择原则。项目三 卵磷脂的制备及鉴定一、实验目的要求1、熟悉鸡蛋黄制备卵磷脂的原理。2、掌握卵磷脂的制备与减压蒸馏的基本操作方法。二、实验重点和难点从蛋黄中制备卵磷脂的操作方法。三、实验原理将卵黄中加乙醇，卵磷脂溶于乙醇溶液中，分离提取，蛋白质等某些杂质

16、从沉淀物中除去。但由于乙醇抽提时，其他脂质也一起被抽提，如甘油三酯、甾醇等。利用卵磷脂不溶于丙酮的性质，用丙酮从粗卵磷脂溶液中沉淀磷脂，能使卵磷脂与其他脂质和胆固醇分离开来。无机盐和卵磷脂可生成络合物沉淀，因此，可利用金属盐沉淀剂将卵磷脂从溶液中分离出来，由此除去蛋白质、脂肪等杂质，再用适当溶剂萃取出无机盐和其他磷脂杂质。四、实验仪器、试剂与材料1、仪器：离心机、旋转薄膜蒸发仪、布氏漏斗、抽滤瓶、真空干燥箱、层析缸、紫外分光光度计。2、试液：l0%的ZnCl2溶液：取氯化锌10g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀，即得。3、试剂与材料：氯化锌、95%乙醇、丙酮、氯仿、碘、甲醇、无水乙醇。五、操

17、作步骤1、粗提：取鸡蛋卵黄适量，用2倍于卵黄体积的95%乙醇混合搅拌、提取，离心分离（300Or/min，5min），将沉淀物重复提取3次，回收上清液。然后减压蒸馏（45）至近干，用少量石油醚洗下粘壁的黄色油状物。加入丙酮溶解，抽滤，分离出沉淀，真空干燥（40，3Omin），得到淡黄色的粗卵磷脂，称重。2、精制：取一定量的卵磷脂粗品，加无水乙醇溶解，得到约10%的乙醇粗提液。加入相当于卵磷脂质量的l0%的ZnCl2溶液，室温搅拌0.5h。分离沉淀物，加适量冰丙酮（4）洗涤，搅拌lh，再用丙酮反复研洗，直到丙酮洗液为近无色止，得到白色蜡状的精制卵磷脂；干燥；称重。3、鉴定：（1）薄层色谱分析：取

18、卵磷脂样品与对照品分别制成2%氯仿溶液，用GF254硅胶板以氯仿：甲醇：水（65：25：4）为展开剂，展开，取出，干燥，碘蒸气显色。（2）紫外吸收光谱测定：将一定量卵磷脂制成0.l%无水乙醇溶液，照紫外分光光法在19040Onm处测定，卵磷脂的紫外最大吸波长在215nm。六、结果与讨论1、计算卵磷脂收率，分析影响卵磷脂收率的主要因素。2、根据薄层色谱图谱、紫外吸收图谱分析所制备的卵磷脂的纯度。项目四 甘露醇的制备及鉴定一、实验目的要求1、熟悉用海藻、海带制备甘露醇的原理。2、掌握甘露醇的制备方法和沉淀、回流、重结晶、脱色等操作方法。二、实验重点和难点海藻、海带制备甘露醇的方法和精制方法。三、实

19、验原理甘露醇在海藻洗涤液和海带洗涤液中的含量分别为2%与1.5%。以海带为原料，用饮用水浸泡提取甘露醇，调节酸度，沉淀除杂质。煮沸浓缩后用乙醇沉淀甘露醇，再通过回流、重结晶、活性炭脱色等工艺精制甘露醇。四、实验仪器、试剂与材料1、仪器：电炉、布式漏斗、抽滤瓶、回流装置。2、试液：（1）30%氢氧化钠溶液：取氢氧化钠30g，加水溶解，放冷，加稀释至100ml，摇匀，即得。（2）（12）硫酸溶液：取硫酸10ml，边搅拌边加入10ml水中，放冷，即得。（3）lmol/L三氯化铁溶液：取三氯化铁27g，加水溶解使成100ml，摇匀，即得。（4）lmol/L氢氧化钠溶液：取氢氧化钠4g，加水溶解，放冷，

20、加稀释至100ml，摇匀，即得。3、试剂与材料：95%乙醇、粉末活性炭、pH试纸、海带。五、操作步骤1、浸泡、碱化、酸化：取海带适量，加20倍量饮用水室温浸泡23h（第一次浸泡液作为第二批原料的提取溶液，一般浸泡4批后，浸泡液中甘露醇含量较高），收集浸泡液用30%氢氧化钠溶液调pH至lO1l，静置8h，凝集沉淀多糖类黏性物质。待海带糖液、淀粉及其他有机黏性物充分凝聚沉淀。虹吸上清液，用（12）硫酸溶液中和至pH67，进一步除去胶状物得中性提取液。2、浓缩、醇洗：用直火或蒸汽加热（温度约为110150）蒸发，有大量氯化钠沉淀析出，不断将盐类与胶污物捞出，直至呈浓缩液，取小样倒于玻璃板上，稍冷却应

21、凝固。将浓缩液冷却至6070时立即加入95%乙醇（2：1），不断搅拌渐渐冷却至室温后，离心甩干除去胶质，得灰白色松散物。3、提取：取松散物加入8倍量的95%乙醇，加热回流3O分钟，静置24小时后以2500r/min离心，得白色松散甘露醇粗品，同法再用乙醇重结晶1次。4、精制：甘露醇粗品加适量纯化水加热溶解，按5%质量加入粉末活性炭不断搅拌，加热至沸腾趁热过滤（或压滤），用少量水洗活性炭2次，合并洗液和滤液（如有浑浊重新过滤），浓缩至脓缩液相对密度为1.2左右时，在搅拌下冷却至室温，低温结晶，抽滤至干，得到结晶甘露醇，干燥，得甘露醇成品。5、鉴定：取甘露醇成品饱和溶液lml，加lmol/L三氯化

22、铁溶液与lmol/L氢氧化钠溶液各0.5ml，即生成棕黄色沉淀，振摇不消失，滴加过量的lmol/L氢氧化钠溶液，即溶解成棕色溶液。可初步断定为甘露醇。六、结果与讨论1、称重，计算甘露醇的收率。2、讨论影响甘露醇的收率因素。项目五 芦丁的提取与鉴定一、实验目的要求1、熟悉黄酮类化合物的提取原理。2、掌握芦丁的提取的基本方法。二、实验重点和难点芦丁的提取的基本方法。三、实验原理芦丁亦称芸香苷，广泛存在于植物界中，其中以槐花米（槐树的花蕾）和乔麦叶中含量较高。槐花米中的含量为1216，已知的成分为：1、芦丁：熔点为177178，为淡黄色小针状结晶。溶解度为：冷水中1：8000，热水中1：200，冷乙

23、醇中1：300，热乙醇中1：30。难溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、氯仿、乙醚及石油醚等溶剂。2、槲皮素（Quercetin）：熔点为316，313314，黄色结晶。溶于热乙醇1：60、冷乙醇1：650，可溶于甲醇、冰醋酸、乙酸乙酯、丙酮、吡啶，不溶于石油醚、乙醚、氯仿和水中，实验室以稀硫酸水解，乙醇重结晶制得。3、皂苷：其粗品为白色粉末，经酸水解后得二种皂甙元及糖的部分，两种皂苷元为桦脂醇和槐花双醇，另外还含有槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。本实验用芦丁在热水冷水溶解度差别较大的性质，用热水提取，然后再利用其在热乙醇和冷乙醇中溶解度的差异，进行精制。四、实验仪器、试剂与材料1、仪器：棉花

24、、500ml烧杯、1000ml烧杯、电热套、漏斗、架盘天平、真空泵、抽滤瓶、布氏漏斗、滤纸、剪刀、冷凝管、蒸馏烧瓶、乳胶管、研钵、量筒、容量瓶、试管、紫外分析仪、层析缸、聚酰胺酯薄层板。2、试液：（1）4mol/L硫酸溶液：取硫酸24ml，边搅拌边加入60ml水中，放冷，加水稀释至100ml，摇匀，即得。（2）1三氯化铝乙醇溶液：取三氯化铝1g，加水溶解使成100ml，摇匀，即得。（3）0.1mol/L硝酸银试液：取硝酸银1.75g，加水溶解使成100ml，摇匀，即得。（4）10氨试液：取氨10ml，加水溶解使成100ml，摇匀，即得。3、试剂与材料：槐米、芦丁对照品、乙醇、硫酸、碳酸钡、盐酸

25、、镁粉、醋酸铅、-萘酚、正丁醇、醋酸、三氯化铝、硝酸银、氨水、氯仿、甲醇、丁酮、乙酰丙酮。五、操作步骤1、芦丁的提取：取20g槐花米于烧杯中漂洗干净，捞取上浮的花蕾，弃去下沉的杂质，将洗净的花蕾置于1000ml烧杯中，加沸水500ml，煮沸50分钟，不断补充蒸发掉的水分，趁热过滤（用棉花），再用200ml水提取40分钟，合并两次滤液，浓缩1/2体积，放置过夜，析出芦丁。抽滤，沉淀用少量冷水洗三次，抽干，60以下干燥，称重计算收率。2、重结晶：将粗制芦丁研细，加95乙醇回流溶解（每2g芦丁加70ml左右乙醇）趁热过滤，滤液浓缩至原体积的1/31/4，放置，析出结晶，抽滤，干燥称重，得精制芦丁，计

26、算收率。3、水解：取1/2量精制芦丁，加少量乙醇回流溶解，然后加4mol/L硫酸溶液（1g芦丁加80ml硫酸）水浴回流1小时，待全部水解后，蒸去乙醇，冷却，析去槲皮素，抽滤，滤液内含糖。槲皮素沉淀经水洗、抽干、干燥，称重，计算收率。再用乙醇重结晶一次，得黄色针晶，为槲皮素精品。含糖的溶液，取10ml于水浴上加热，同时于搅拌下加碳酸钡细粉中各至中性，滤除白色的硫酸钡沉淀，滤液在水浴上浓缩至12ml，供纸层析用。4、层析鉴定：（1）槲皮素和芦丁的纸层析鉴定：1）点样：取层析滤纸距下端3cm处用铅笔划线，为原点线，每隔1.5cm处点样品，将点好样品的滤纸在层析缸中饱和30分钟，再上行展开。2）试液：

27、芦丁乙醇液、芦丁标准品乙醇液、精制槲皮素乙醇液。3）展开剂：正丁醇-醋酸-水4：1：5。4）显色：可见光下观察色斑，紫外灯下观察萤光光斑点；喷1三氯化铝乙醇溶液再观察萤光斑点。（2）糖的纸层析鉴定：1）点样：取一号滤纸距下端3cm处用铅笔划线，为原点线，每隔1.5cm处点样品，将点好样品的滤纸在层析缸中饱和30分钟，再上行展开。2）试液：水解液、葡萄糖水溶液、鼠李糖水溶液。3）展开剂：正丁醇-醋酸-水4：1：5。4）显色：氨性硝酸银溶液（临用时等量0.1mol/L硝酸银试液与10氨试液混合而成）喷洒，加热观察色斑。（3）槲皮素和芦丁的薄层层析鉴定：1）固定相：聚酰胺酯薄层板。2）样品：精制芦丁

28、、芦丁标准品、精制槲皮素。3）展开剂：氯仿-甲醇-丁酮-乙酰丙酮16：10：5：1。4）显色：可见光下观察色斑，紫外灯下观察萤光光斑点；喷1三氯化铝乙醇液再观察萤光斑点。六、结果与讨论1、计算芦丁收率，讨论影响收率的因素。2、根据色谱结果分析所制备的芦丁纯度。参考文献1林元藻，王凤山.生化制药学.北京：人发卫生出版社.1998.2陈可夫.生化制药技术.北京.化学工业出版社.2008.3辛秀兰.现代生物制药工艺学.北京.化学工业出版社.2006.4贾士儒.生物工艺与工程实验技术.北京.中国轻工业出版社.2002.5芦艳花，魏东芝，蒋晓萌.中药有效成分提取分离技术.北京.化学工业出版社.2007.