生化提取实验讲义.docx

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生化提取实验讲义

生化制药技术

威海职业学院

生物与化学工程系

二0一一年二月

前言……………………………………………………………………………………………1

项目一L-胱氨酸的制备与鉴定……………………………………………………………2

项目二溶菌酶的制备………………………………………………………………………4

项目三卵磷脂的制备及鉴定………………………………………………………………6

项目四甘露醇的制备及鉴定………………………………………………………………7

项目五芦丁的提取与鉴定…………………………………………………………………9

参考文献……………………………………………………………………………………11

前言

《生化制药技术》是生化制药技术专业的专业核心课程之一，生化制药技术实验实训指导书是本课程的重要组成部分。

根据该课程教学大纲的规定，学生在掌握一定生化药品制备技术理论知识的基础上，必须通过实验实训学习，掌握生化药品制备常用的提取、分离、精制、干燥等方法和实验操作技术，培养学生科学认真的工作态度和熟练的基本操作技能。

本实验实训指导书的编写，主要参照《生化制药技术》、《现代生物制药工艺学》、《天然植物化学》等参考资料所收载的部分内容，结合本专业实训基地现有的实验实训条件，从中选出较为典型的生化药品实例的制备方法，供学生实验学习使用。

实验设计包括氨基酸、蛋白质、酶、脂及多糖类等，生化药品制备与鉴定基本操作技术，以培养学生进行生化药品的生产制造与鉴别的能力。

为了完成本课程实验实训教学大纲的学习内容，要求学生实验实训课前，必须认真预习，明确实验目的，熟悉实验内容和方法，并结合课堂教学，理解实验的基本原理；实验中必须有严谨的科学态度和实事求是的工作作风；严格操作，正确使用仪器，认真观察实验现象，详细、真实地做好实验原始记录；实验报告要求书写正确规范；严格遵守实验室规章制度，注意安全，保持室内卫生。

本实验实训指导书由李顺康、高英霞、殷永新、肖凤华、元超老师编写完成，主要供生化制药技术实验实训的学生参考。

由于编者按水平有限，加之时间仓促，如有不当之处，恳请读者批评指正。

——编者

项目一L-胱氨酸的制备及鉴定

一、实验目的要求

1、熟悉用人发制备氨基酸类药物的原理。

2、掌握水解法制备氨基酸的方法。

二、实验重点和难点

L-胱氨酸的制备与精制方法。

三、实验原理

蛋白质由一定数量的氨基酸经过特定的排列方式组合而成的。

因此，在一定条件下将蛋白质水解可得到各种氨基酸的混合液，再经过进一步的提取、精制，即可得到所需的氨基酸。

本实验是用已洗净并干燥的人发，先用酸水解，然后调节pH至胱氨酸等当点（5.05左右）时，胱氨酸从水解液中沉淀出来，经精制得到其结晶。

四、实验仪器、试剂与材料

1、仪器：

500ml短颈圆底烧瓶、冷凝管、电热套、玻璃漏斗、玻璃棒、抽滤瓶、布氏漏斗、恒温水浴锅、真空泵、表面皿、烧杯、滤纸。

2、试液：

（1）10mol/L盐酸溶液：

取盐酸90ml加水稀释至100ml，摇匀，即得。

（2）6%盐酸溶液：

取盐酸6ml加水稀释至100ml，摇匀，即得。

（3）10%氢氧化钠溶液：

取氢氧化钠10g，加水溶解，放冷，加稀释至100ml，摇匀，即得。

（4）25%氢氧化钠溶液：

取氢氧化钠25g，加水溶解，放冷，加稀释至100ml，摇匀，即得。

（5）10%氨水溶液：

取氨10ml加水稀释至100ml，摇匀，即得。

（6）2%硫酸铜溶液：

取硫酸铜2g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀，即得。

（7）0.1%EDTA溶液：

取乙二胺四乙酸二钠0.1g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀，即得。

（8）75%乙醇溶液：

取无水乙醇75ml加水稀释至100ml，摇匀，即得。

（9）0.5%茚三酮-丙酮溶液：

取茚三酮0.5g，加丙酮溶解并稀释至100ml，摇匀，即得。

3、试剂与材料：

胱氨酸对照品、粉末活性炭、苯酚、盐酸、氢氧化钠、氨、硫酸铜、乙二胺四乙酸二钠、无水乙醇、95%乙醇、茚三酮、丙酮、人发。

五、实验操作

1、人发的处理：

取无染色的人发，用碱性或中性洗涤剂洗净，用清水洗至水呈中性，晾干并剪短备用。

2、回流装置安装：

在回流冷凝管上端接一弯玻璃管，下连一小漏斗用水封住，漏斗刚好接触水面，但不能伸到水中以免倒吸，避免氯化氢气体自仪器中逸出到空气中。

3、水解：

称取人发50g，置圆底烧瓶中，加10mol/L盐酸溶液100ml，加沸石或玻璃珠3粒，加热回流6～7小时，回流过程保持缓缓沸腾。

水解完全后应不呈双缩脲反应，可停止反应，否则应继续水解至反应完全。

4、双缩脲检查：

取水解液3ml，加入少量粉末活性炭，在80℃水浴中脱色数分钟，过滤；向滤液中加10%氢氧化钠溶液3ml使呈碱性，然后沿管壁加2%硫酸铜溶液4～5滴，观察有无紫红色出现，若出现，水解未完全需继续水解。

5、胱氨酸粗品制备：

将水解液趁热过滤除去残渣，滤液呈深棕色。

当滤液温度降至60℃左右时在不断搅拌下，逐滴加入25%氢氧化钠溶液调pH至4.8～5.0，即产生胱氨酸沉淀。

然后，置冷处过夜使沉淀完全，次日将沉淀置布氏漏斗中抽滤，并于50～60℃干燥，得到胱氨酸粗品Ⅰ。

6、结晶：

称取胱氨酸粗品Ⅰ放入100ml烧杯中，加粗品4倍量4%盐酸溶液，加热至80℃左右，在不断搅拌下加约相当于胱氨酸粗品量15%的粉末活性炭，搅拌50分钟趁热抽滤。

将滤液置于恒温水浴中加热至60℃不断搅拌下慢慢加25%氢氧化钠溶液，调pH至4.8～5.0，即有白色结晶迅速析出，放置5～6h后（在更长时间酪氨酸也可能与胱氨酸一同结晶出来）抽滤，得胱氨酸粗品Ⅱ。

7、再次脱色并脱铁：

取胱氨酸粗品Ⅱ放入100ml烧杯中，加8倍粗品Ⅱ量6%盐酸溶液、5%粗品Ⅱ量粉末活性炭与0.1%EDTA溶液2ml，在80℃恒温水浴中搅拌30分钟，趁热减压抽滤。

8、重结晶精制：

将滤液置于60℃恒温水浴中，逐滴加10%氨溶液，调pH值至4.0（必须一滴一滴加，并不停的搅拌）左右，白色的胱氨酸结晶逐渐析出，放置过夜，抽滤，用少量纯化水洗涤结晶，再用75%乙醇洗涤，抽干。

将胱氨酸纯品置表面皿上，于50～60℃干燥，称重，计算产率。

9、纯度鉴定：

称取胱氨酸样品与对照品适量，配成相同浓度的溶液，用纸色谱法检查，以苯酚：

水（7：

3）为展开剂，以0.5%茚三酮-丙酮溶液为显色剂。

在色谱图上应为单一斑点，Rf值应符合规定。

六、结果与讨论

1、计算胱氨酸收率，讨论影响收率的因素。

2、根据纸色谱结果分析所制备的胱氨酸纯度。

项目二溶菌酶的制备

一、实验目的要求

1、熟悉鸡蛋清制备溶菌酶的原理。

2、掌握树脂吸附法、透析法及盐析法用于制备酶类药物的基本操作方法。

二、实验重点和难点

从蛋清中制备溶菌酶的工艺和操作方法。

三、实验原理

溶菌酶（EC3.2.1.17），又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。

是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基及芳香族氨基酸（如色氨酸）的比例很高。

pH在l.2～11.3范围内剧烈变化时，其结构几乎不变，遇热也很稳定。

在pH4～7，10O℃处理lmin仍保持原酶活性；pH5.5，5O℃加热4h后，酶变得更活泼；热变性是可逆的，变性的临界点是77℃。

随溶剂的变化变性临界点也有变化，当变性剂在pH1以下时，变性临界点降低到43℃。

变性剂能促进酶的热变性，但变性剂过量时则酶的热变性变为不可逆。

在碱性环境中用高温处理时，酶活性降低。

十二烷基磺酸钠等对酶有抑制作用；滤纸也能抑制酶活性；氧化剂能使酶纯化；在6mol/L的盐酸胍溶液中酶完全变性；而在lOmol/L尿素中酶则不变性；用乙二醇、丙烯乙二醇、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、二氧杂环乙烷等有机溶剂进行变性实验，在5O℃以下时除乙醇、二氧杂环乙烷外，其他变性剂的浓度要在50%以上时才能使溶菌酶变性；氢氰酸能部分恢复酶活力。

四、实验仪器、试剂与材料

1、仪器：

磁力搅拌器、电热套、电炉、蒸馏装置、压片机、真空抽滤装置、透析袋、电动搅拌器、真空干燥箱。

2、试液：

（1）0.15mol/L磷酸缓冲液（pH6.5）：

取磷酸二氢钾0.68g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液15.2ml，用水稀释至100ml，即得。

（2）10%硫酸铵溶液：

取硫酸铵10g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀，即得。

（3）lmol/L氢氧化钠溶液：

取氢氧化钠4g，加水溶解，放冷，加稀释至100ml，摇匀，即得。

（4）3mol/L盐酸溶液：

取盐酸27ml加水稀释至100ml，摇匀，即得。

3、试剂与材料：

乙醇、乙醚、无水硫酸钠、丙酮、磷酸、硫酸铵、氢氧化钠、氯化钠、淀粉、砂糖、滑石粉、鸡蛋、724树脂、漏斗、滤纸、60～80目筛子。

五、操作步骤

1、原料处理：

新鲜蛋清250g，测pH为8左右，除去蛋清中的脐带、蛋壳碎片及其他杂质。

2、吸附：

温度降到5℃左右，在搅拌中加入处理好的724树脂50g（湿重）使树脂全部悬浮在蛋清中，在0～5℃搅拌吸附5h，再将蛋清在0～5℃静置过夜。

3、去杂蛋白、洗脱、沉淀：

渐渐倾出上清液，树脂用清水洗去吸附的蛋白质，反复洗4次，注意防止树脂流失，最后将树脂抽滤去水分。

另取0.15mol/L磷酸缓冲液（pH6.5）15Oml分3次加入树脂中搅拌l5min，每次搅拌后减压抽滤去水分，再取10%硫酸铵溶液200m1，分4次洗脱溶菌酶，每次搅拌半小时，过滤抽干，合并洗脱液，按总体积加入32%固体硫酸铵（质量体积比）使含量达到40%，有白色沉淀析出。

冷处放置过夜虹吸上清液，沉淀离心分离或抽滤，得粗制品。

4、透析：

将粗制品加纯化水50ml使溶解，装入透析袋中在0～5℃透析24～36h，除去大部分硫酸铵，得透析液。

5、盐析：

向澄清透析液中慢慢滴加lmol/L氢氧化钠溶液，随加随搅拌至pH值为8.5～9，如有白色沉淀应立即离心除去。

然后在搅拌下加入3mol/L盐酸溶液使pH为3.5，按体积比缓缓加入5%固体氯化钠，即有白色沉淀析出。

在0.5℃放置48h离心或过滤溶菌酶沉淀。

6、干燥：

沉淀加入10倍量冷至O℃的无水丙酮，不断搅拌使颗粒松散。

冷处静置数小时，用漏斗滤去丙酮，沉淀用真空干燥直至无水丙酮脱水，即得溶菌酶。

7、制剂：

取干燥砂糖粉，加入总量5%的滑石粉，通过120目筛；加5%淀粉，在搅拌机内搅拌均匀，制成软材，12目筛制粒；55℃烘干，用14目筛整颗粒，水分以控制在2%～4%左右为宜；再按计算量加入溶菌酶粉混合，加1%硬脂酸镁，过16目筛2次，压制成溶菌酶口含片，每片含2Omg。

六、注意事项

1、注意原料的卫生，防止细菌污染变质，pH8～9，不要掺入蛋黄和其他杂质，避免影响收率和树脂对酶的吸附能力，操作的全过程要在低温（0～10℃）下进行，防止蛋清发酸、变质和酶失活。

2、树脂再生、转型要彻底，提高收率。

转为钠型后再用0.l5mol/L磷酸缓冲液（pH6.5）平衡过夜，平衡液的pH要保持在6.5。

用过的树脂可用饱和氢氧化钠及浓盐酸直接浸泡，再生和转型后，再用缓冲液平衡。

3、溶菌酶的洗脱峰较宽，有拖尾现象，可用三氯乙酸检查洗脱液，如沉淀不明显应另行收集，用作下次洗脱用。

4、透析液加碱去杂蛋白时，碱液应均匀加入，勿使局部浓度过高造成酶失活。

七、结果与讨论

1、称重，计算溶菌酶的收率。

2、讨论影响溶菌酶收率的因素。

3、分析提取溶菌酶所需要树脂的选择原则。

项目三卵磷脂的制备及鉴定

一、实验目的要求

1、熟悉鸡蛋黄制备卵磷脂的原理。

2、掌握卵磷脂的制备与减压蒸馏的基本操作方法。

二、实验重点和难点

从蛋黄中制备卵磷脂的操作方法。

三、实验原理

将卵黄中加乙醇，卵磷脂溶于乙醇溶液中，分离提取，蛋白质等某些杂质从沉淀物中除去。

但由于乙醇抽提时，其他脂质也一起被抽提，如甘油三酯、甾醇等。

利用卵磷脂不溶于丙酮的性质，用丙酮从粗卵磷脂溶液中沉淀磷脂，能使卵磷脂与其他脂质和胆固醇分离开来。

无机盐和卵磷脂可生成络合物沉淀，因此，可利用金属盐沉淀剂将卵磷脂从溶液中分离出来，由此除去蛋白质、脂肪等杂质，再用适当溶剂萃取出无机盐和其他磷脂杂质。

四、实验仪器、试剂与材料

1、仪器：

离心机、旋转薄膜蒸发仪、布氏漏斗、抽滤瓶、真空干燥箱、层析缸、紫外分光光度计。

2、试液：

l0%的ZnCl2溶液：

取氯化锌10g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀，即得。

3、试剂与材料：

氯化锌、95%乙醇、丙酮、氯仿、碘、甲醇、无水乙醇。

五、操作步骤

1、粗提：

取鸡蛋卵黄适量，用2倍于卵黄体积的95%乙醇混合搅拌、提取，离心分离（300Or/min，5min），将沉淀物重复提取3次，回收上清液。

然后减压蒸馏（45℃）至近干，用少量石油醚洗下粘壁的黄色油状物。

加入丙酮溶解，抽滤，分离出沉淀，真空干燥（40℃，3Omin），得到淡黄色的粗卵磷脂，称重。

2、精制：

取一定量的卵磷脂粗品，加无水乙醇溶解，得到约10%的乙醇粗提液。

加入相当于卵磷脂质量的l0%的ZnCl2溶液，室温搅拌0.5h。

分离沉淀物，加适量冰丙酮（4℃）洗涤，搅拌lh，再用丙酮反复研洗，直到丙酮洗液为近无色止，得到白色蜡状的精制卵磷脂；干燥；称重。

3、鉴定：

（1）薄层色谱分析：

取卵磷脂样品与对照品分别制成2%氯仿溶液，用GF254硅胶板以氯仿：

甲醇：

水（65：

25：

4）为展开剂，展开，取出，干燥，碘蒸气显色。

（2）紫外吸收光谱测定：

将一定量卵磷脂制成0.l%无水乙醇溶液，照紫外分光光法在190～40Onm处测定，卵磷脂的紫外最大吸波长在215nm。

六、结果与讨论

1、计算卵磷脂收率，分析影响卵磷脂收率的主要因素。

2、根据薄层色谱图谱、紫外吸收图谱分析所制备的卵磷脂的纯度。

项目四甘露醇的制备及鉴定

一、实验目的要求

1、熟悉用海藻、海带制备甘露醇的原理。

2、掌握甘露醇的制备方法和沉淀、回流、重结晶、脱色等操作方法。

二、实验重点和难点

海藻、海带制备甘露醇的方法和精制方法。

三、实验原理

甘露醇在海藻洗涤液和海带洗涤液中的含量分别为2%与1.5%。

以海带为原料，用饮用水浸泡提取甘露醇，调节酸度，沉淀除杂质。

煮沸浓缩后用乙醇沉淀甘露醇，再通过回流、重结晶、活性炭脱色等工艺精制甘露醇。

四、实验仪器、试剂与材料

1、仪器：

电炉、布式漏斗、抽滤瓶、回流装置。

2、试液：

（1）30%氢氧化钠溶液：

取氢氧化钠30g，加水溶解，放冷，加稀释至100ml，摇匀，即得。

（2）（1→2）硫酸溶液：

取硫酸10ml，边搅拌边加入10ml水中，放冷，即得。

（3）lmol/L三氯化铁溶液：

取三氯化铁27g，加水溶解使成100ml，摇匀，即得。

（4）lmol/L氢氧化钠溶液：

取氢氧化钠4g，加水溶解，放冷，加稀释至100ml，摇匀，即得。

3、试剂与材料：

95%乙醇、粉末活性炭、pH试纸、海带。

五、操作步骤

1、浸泡、碱化、酸化：

取海带适量，加20倍量饮用水室温浸泡2～3h（第一次浸泡液作为第二批原料的提取溶液，一般浸泡4批后，浸泡液中甘露醇含量较高），收集浸泡液用30%氢氧化钠溶液调pH至lO～1l，静置8h，凝集沉淀多糖类黏性物质。

待海带糖液、淀粉及其他有机黏性物充分凝聚沉淀。

虹吸上清液，用（1→2）硫酸溶液中和至pH6～7，进一步除去胶状物得中性提取液。

2、浓缩、醇洗：

用直火或蒸汽加热（温度约为110～150℃）蒸发，有大量氯化钠沉淀析出，不断将盐类与胶污物捞出，直至呈浓缩液，取小样倒于玻璃板上，稍冷却应凝固。

将浓缩液冷却至60～70℃时立即加入95%乙醇（2：

1），不断搅拌渐渐冷却至室温后，离心甩干除去胶质，得灰白色松散物。

3、提取：

取松散物加入8倍量的95%乙醇，加热回流3O分钟，静置24小时后以2500r/min离心，得白色松散甘露醇粗品，同法再用乙醇重结晶1次。

4、精制：

甘露醇粗品加适量纯化水加热溶解，按5%质量加入粉末活性炭不断搅拌，加热至沸腾趁热过滤（或压滤），用少量水洗活性炭2次，合并洗液和滤液（如有浑浊重新过滤），浓缩至脓缩液相对密度为1.2左右时，在搅拌下冷却至室温，低温结晶，抽滤至干，得到结晶甘露醇，干燥，得甘露醇成品。

5、鉴定：

取甘露醇成品饱和溶液lml，加lmol/L三氯化铁溶液与lmol/L氢氧化钠溶液各0.5ml，即生成棕黄色沉淀，振摇不消失，滴加过量的lmol/L氢氧化钠溶液，即溶解成棕色溶液。

可初步断定为甘露醇。

六、结果与讨论

1、称重，计算甘露醇的收率。

2、讨论影响甘露醇的收率因素。

项目五芦丁的提取与鉴定

一、实验目的要求

1、熟悉黄酮类化合物的提取原理。

2、掌握芦丁的提取的基本方法。

二、实验重点和难点

芦丁的提取的基本方法。

三、实验原理

芦丁亦称芸香苷，广泛存在于植物界中，其中以槐花米（槐树的花蕾）和乔麦叶中含量较高。

槐花米中的含量为12～16％，已知的成分为：

1、芦丁：

熔点为177～178℃，为淡黄色小针状结晶。

溶解度为：

冷水中1：

8000，热水中1：

200，冷乙醇中1：

300，热乙醇中1：

30。

难溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、氯仿、乙醚及石油醚等溶剂。

2、槲皮素（Quercetin）：

熔点为316℃，313～314℃，黄色结晶。

溶于热乙醇1：

60、冷乙醇1：

650，可溶于甲醇、冰醋酸、乙酸乙酯、丙酮、吡啶，不溶于石油醚、乙醚、氯仿和水中，实验室以稀硫酸水解，乙醇重结晶制得。

3、皂苷：

其粗品为白色粉末，经酸水解后得二种皂甙元及糖的部分，两种皂苷元为桦脂醇和槐花双醇，另外还含有槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。

本实验用芦丁在热水冷水溶解度差别较大的性质，用热水提取，然后再利用其在热乙醇和冷乙醇中溶解度的差异，进行精制。

四、实验仪器、试剂与材料

1、仪器：

棉花、500ml烧杯、1000ml烧杯、电热套、漏斗、架盘天平、真空泵、抽滤瓶、布氏漏斗、滤纸、剪刀、冷凝管、蒸馏烧瓶、乳胶管、研钵、量筒、容量瓶、试管、紫外分析仪、层析缸、聚酰胺酯薄层板。

2、试液：

（1）4mol/L硫酸溶液：

取硫酸24ml，边搅拌边加入60ml水中，放冷，加水稀释至100ml，摇匀，即得。

（2）1％三氯化铝乙醇溶液：

取三氯化铝1g，加水溶解使成100ml，摇匀，即得。

（3）0.1mol/L硝酸银试液：

取硝酸银1.75g，加水溶解使成100ml，摇匀，即得。

（4）10％氨试液：

取氨10ml，加水溶解使成100ml，摇匀，即得。

3、试剂与材料：

槐米、芦丁对照品、乙醇、硫酸、碳酸钡、盐酸、镁粉、醋酸铅、α-萘酚、正丁醇、醋酸、三氯化铝、硝酸银、氨水、氯仿、甲醇、丁酮、乙酰丙酮。

五、操作步骤

1、芦丁的提取：

取20g槐花米于烧杯中漂洗干净，捞取上浮的花蕾，弃去下沉的杂质，将洗净的花蕾置于1000ml烧杯中，加沸水500ml，煮沸50分钟，不断补充蒸发掉的水分，趁热过滤（用棉花），再用200ml水提取40分钟，合并两次滤液，浓缩1/2体积，放置过夜，析出芦丁。

抽滤，沉淀用少量冷水洗三次，抽干，60℃以下干燥，称重计算收率。

2、重结晶：

将粗制芦丁研细，加95％乙醇回流溶解（每2g芦丁加70ml左右乙醇）趁热过滤，滤液浓缩至原体积的1/3～1/4，放置，析出结晶，抽滤，干燥称重，得精制芦丁，计算收率。

3、水解：

取1/2量精制芦丁，加少量乙醇回流溶解，然后加4mol/L硫酸溶液（1g芦丁加80ml硫酸）水浴回流1小时，待全部水解后，蒸去乙醇，冷却，析去槲皮素，抽滤，滤液内含糖。

槲皮素沉淀经水洗、抽干、干燥，称重，计算收率。

再用乙醇重结晶一次，得黄色针晶，为槲皮素精品。

含糖的溶液，取10ml于水浴上加热，同时于搅拌下加碳酸钡细粉中各至中性，滤除白色的硫酸钡沉淀，滤液在水浴上浓缩至1～2ml，供纸层析用。

4、层析鉴定：

（1）槲皮素和芦丁的纸层析鉴定：

1）点样：

取层析滤纸距下端3cm处用铅笔划线，为原点线，每隔1.5cm处点样品，将点好样品的滤纸在层析缸中饱和30分钟，再上行展开。

2）试液：

芦丁乙醇液、芦丁标准品乙醇液、精制槲皮素乙醇液。

3）展开剂：

正丁醇-醋酸-水4：

1：

5。

4）显色：

可见光下观察色斑，紫外灯下观察萤光光斑点；喷1％三氯化铝乙醇溶液再观察萤光斑点。

（2）糖的纸层析鉴定：

1）点样：

取一号滤纸距下端3cm处用铅笔划线，为原点线，每隔1.5cm处点样品，将点好样品的滤纸在层析缸中饱和30分钟，再上行展开。

2）试液：

水解液、葡萄糖水溶液、鼠李糖水溶液。

3）展开剂：

正丁醇-醋酸-水4：

1：

5。

4）显色：

氨性硝酸银溶液（临用时等量0.1mol/L硝酸银试液与10％氨试液混合而成）喷洒，加热观察色斑。

（3）槲皮素和芦丁的薄层层析鉴定：

1）固定相：

聚酰胺酯薄层板。

2）样品：

精制芦丁、芦丁标准品、精制槲皮素。

3）展开剂：

氯仿-甲醇-丁酮-乙酰丙酮16：

10：

5：

1。

4）显色：

可见光下观察色斑，紫外灯下观察萤光光斑点；喷1％三氯化铝乙醇液再观察萤光斑点。

六、结果与讨论

1、计算芦丁收率，讨论影响收率的因素。

2、根据色谱结果分析所制备的芦丁纯度。

参考文献

[1]林元藻，王凤山.生化制药学.北京：

人发卫生出版社.1998.

[2]陈可夫.生化制药技术.北京.化学工业出版社.2008.

[3]辛秀兰.现代生物制药工艺学.北京.化学工业出版社.2006.

[4]贾士儒.生物工艺与工程实验技术.北京.中国轻工业出版社.2002.

[5]芦艳花，魏东芝，蒋晓萌.中药有效成分提取分离技术.北京.化学工业出版社.2007.