从葡萄籽中提取的寡聚原花青素在激活的肝星状细胞中抑制NFkB信号传导.docx

1、从葡萄籽中提取的寡聚原花青素在激活的肝星状细胞中抑制NFkB信号传导从葡萄籽中提取的寡聚原花青素在激活的肝星状细胞中抑制NFkB信号传导: 参与JNK /ERK MAPK和PI3K / Akt通路在本研究中，我们旨在揭示葡萄籽中低聚原花青素（OPC）对脂多糖（LPS）活化，HSC-T6，大鼠肝星状细胞系的潜在抗纤维化作用.。HSC-T6细胞在加入LPS前用OPC处理1小时，然后在指定时间内孵育。OPC抑制HSC-T6细胞的细胞活力，并减少在lps诱导的HSC-T6细胞中胶原蛋白I，-平滑肌肌动蛋白（a-SMA），金属蛋白酶I（TIMP-1）组织抑制剂在LPS诱导的蛋白表达。OPC还显着抑制LP

2、S刺激的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K），蛋白激酶B（Akt），细胞外信号调节激酶（ERK）和c-Jun N-末端激酶（JNK）的磷酸化。 此外，OPC预处理阻止LPS-引发的核因子B（NF-kB）从细胞质转移到核。 OPC，以及NF-kB，PI3K和JNK的特异性抑制剂可以有效抑制-SMA和胶原蛋白I的表达。 总之，我们证实了OPC的抗纤维化机制可能通过JNK / ERK MAPK和PI3K / Akt磷酸化抑制NF-kB的活化来参与HSC活化和转分化的抑制。 因此，OPC通过涉及MAPK-PI3K / AKT途径的NF-kB调节具有HSC活化的潜在抑制性质。1.介绍肝纤维化是慢性肝炎的常见病

3、理结果，最终会导致肝硬化甚至肝癌。肝纤维化进展的特点是细胞外基质过多(ECM)沉积，包括胶原蛋白I和平滑肌肌动蛋白(a - sma) 1。活化的肝星状细胞(HSC)在肝纤维化中起着关键作用，所以控制肝星状细的活化是抗纤维化治疗的理想靶点。2通过不同的刺激，静止的肝星状细胞被激活和分化，然后由肝星状细胞产生的大量的细胞外基质(ECM)沉积于纤维组织3,4。在HSC激活过程中，ECM定量地和定性地增加。这些过度的ECM导致了ECM降解与生成的不平衡。因此，抑制HSC的增殖和活化是一种理想肝纤维化的治疗方法。脂多糖(LPS)，革兰氏阴性细菌的主要细胞壁成分，是toll样受体4(TLR4)的主要配体，

4、在许多类型的肝细胞中表达，包括Kupffer细胞，肝细胞和HSCs。特别是,TLR4在HSC中的表达在肝纤维化中起关键作用5。肝损伤后,肠粘膜渗透性增加，导致内毒素易位增加6。虽然库普弗细胞是LPS的最佳表征靶点，但HSC也对低浓度的肠源性内毒素具有高度的反应7。在人肝标本分离的活化HSC中也观察到LPS诱导的核因子-B（NF-kB）活化8。NF-kB在HSC活化和纤维发生的进程中起关键作用9nf - kb是二聚体转录因子家族，在肝纤维化的发展过程中起着核心作用10。nf - kb激活发生在活化的HSCs中，nf - kb抑制剂可以有效阻断小鼠肝纤维化11。因此，阻断nf - kb信号通路可以

5、抑制HSC激活，进而减弱肝纤维化。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/ Akt通路可增强NF-kB的转录活性12 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI3K /蛋白激酶B（AKT）之间的串扰可能会调节细胞存活13 JNK，PI3K和Akt的激活诱导具有促纤维化作用的HSC的激活14,15。已经使用药理学或遗传学方法建立了对HSC中PI3K / Akt信号传导的抑制，从而抑制HSC的激活16。因此，通过MAPK和PI3K / Akt途径靶向NF-kB的新药物和方法可能有益于阻断肝纤维化进展。因此，通过MAPK和PI3K / Akt途径靶向NF-kB的新药物和方法可能有益于阻断肝纤维化进展。低分子原花青素

6、复合物（OPC，也称为原花青素），一类类黄酮化合物，通常从葡萄籽以及各种水果和蔬菜中获得，具有有效和广泛的药理和治疗活性17。OPC是一种高分子量的聚合物，包括原花青素，原花翠素类和花葵素 18 。OPC是功能强大的抗氧化剂，可以摆脱自由基。丰富的体内科学证据表明，OPC防护小鼠酒精 - 四氯化碳 - ，二甲基亚硝胺 - 或硫代乙酰胺 - 诱导的肝纤维化19-22。来自蓝莓V.virgatum的叶片的原花青素阻断了血小板衍生生长因子（PDGF）诱导的人类HSC活化23，表明OPC可能是肝纤维化的潜在治疗剂。然而，OPC在抑制通过MAPK和PI3K / Akt信号传导的HSC活化的确切机制迄今尚

7、未得到充分阐明。在目前的研究中，我们利用LPS激活的HSC体外模型来研究OPC的潜在抗纤维化作用。我们的数据表明OPC通过在纤维化过程中抑制NF-kB活化来抑制HSC转分化，并且这些事件可能由ERK / JNK MAPK和PI3K / Akt途径介导。2.材料和方法2.1材料来自于伊方科技有限公司（中国天津）的葡萄籽中的OPC（纯度 99.80）。LPS和二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma Chemicals Co.（St Louis，MO，美国）。OPC溶解于DMSO中，细胞DMSO浓度小于0.5，不影响细胞生长24。抗PI3K，抗磷酸化PI3K，抗Akt和抗磷酸化Akt抗体购自Cell

8、Signaling Technology（Beverly，MA，USA）。抗NF-kB p65和抗Topo I抗体购自Santa Cruz Biotechnology Inc.（Dallas，Texas，USA）。 抗肌动蛋白和抗-SMA抗体购自Abcam（Cambridge，MA，USA）。 JSH23（NF-kB抑制剂），Ly294002（PI3K抑制剂）和SP600125（JNK抑制剂）购自Sigma-Aldrich。 BCA蛋白测定试剂盒购自Beyotime Inst。生物技术。 （中国江苏）。 所有细胞培养物均购自Fischer Scientific。2.2 细胞培养将HSC-T6细

9、胞在含有5CO 2 -95空气的湿润培养箱中，在含有10胎牛血清（FBS），100单位/ ml青霉素G钠和100mg / ml链霉素的DMEM中培养。 HSC-T6是永生化的大鼠肝星状细胞系，具有原代HSC的特异性表型和功能。2.3通过MTT法测定细胞活力使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基咔唑溴化物（MTT）测定法测量细胞活力。 将HSC-T6细胞以110 4个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在存在或不存在OPC的条件下处理24小时。 加入MTT，然后再培养3小时。 抽出含有MTT的培养基，用DMSO代替。 使用酶标仪在540 nm检测MTT对紫色番茄的减少。2.4。 蛋

10、白质印迹分析从HSC-T6细胞中提取总蛋白，用Western和IP的裂解缓冲液提取，用核和细胞质蛋白提取试剂盒（中国江苏省生物技术研究所）制备核和胞质提取物。 通过8-12的十二烷基磺酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离等量的蛋白质，然后转移到PVDF膜。 并用含有5脱脂乳和0.05吐温20的PBS封闭膜，然后与特异性一级抗体一起温育，随后与HRP-缀合的二抗孵育。 最后，用增强型化学发光（ECL）检测系统（Beyotime，Nanjing，Jiangsu，China）显现目标蛋白，并暴露于X射线胶片。 用Bio-Rad Quantity One软件分析每个条带的密度。 b-肌

11、动蛋白用作加载对照。2.5。 免疫细胞化学染色细胞在6孔板中的盖玻片上生长，然后在不存在或存在LPS的情况下用OPC处理。 细胞用4多聚甲醛固定，然后在0.1TritonX-100中透化，然后用PBS中10山羊血清封闭。 之后，将细胞在第一抗体中在4下孵育过夜，然后进行FITC-缀合的第二抗体孵育。 用含有DAPI（Abcam）的荧光载体培养基安装细胞，然后将Olympus BX53荧光显微镜或Olympus FluoViewTM FV10i共焦激光扫描生物显微镜显像。2.6。 统计分析数据以平均值表示？ 标准差（SD）。 通过单因素方差分析（ANOVA）评估统计学意义。 显着性水平（P值）小

12、于0.05。 所有统计分析均使用GraphPad Prism v6软件（Graphpad Software Inc.，USA）进行。3.结果3.1。 OPC抑制LPS激活的HSC-T6细胞的肝纤维化标志物首先，我们确定了HSC-T6细胞的活力。 OPC（0-40mg / ml）在24小时内浓度依赖性降低HSC-T6细胞活力（图1A）。 OPC的IC50为54.20mg / ml。 LPS统计增加HSC-T6细胞活力，这与以前的报道一致25,26，表明LPS可以刺激HSC的活化。在LPS存在下用OPC处理的HSC-T6细胞也表现出细胞活力下降的趋势（图1B）。据报道姜黄素通过抑制HSC活化来保护

13、肝纤维化，并且对治疗肝纤维化具有很高的治疗意义27,28。正在进行一系列临床研究以研究姜黄素对人类肝脏疾病的影响（www.ClinicalTrials.gov）。因此，我们使用姜黄素作为阳性对照，我们也在以前的研究中使用姜黄素作为阳性对照29。 OPC在20和40mg / ml的共振中表现出与HSC-T6细胞中的姜黄素相当的细胞毒性，表明OPC具有HSC活力的潜在抑制特性。为了证实OPC的抗纤维化作用，我们确定蛋白M.Giang等。 通过蛋白质印迹法分析胶原蛋白I，SMA和TIMP-1的表达.LPS处理增加肝纤维化标志物，如胶原I，a-SMA和TIMP-1，而用OPC预处理 在LPS治疗之前，

14、以浓度依赖性方式抑制LPS诱导的肝纤维化标志物蛋白表达增加（图2A和2B）。 我们的数据证实，通过OPC抑制ECM生成可能与降低的HSC增殖有关。图1. OPC对HSC-T6细胞活力的影响。 在不存在（A）或存在（B）LPS的情况下，用不同浓度的OPC或姜黄素预处理HSC-T6细胞24小时。 P 0.5，# P 0.001，与未处理的HSC-T6细胞相比有明显差异; * P 0.001，与LPS处理的HSC-T6细胞相比显着不同。3.2。 OPC抑制激活的HSC-T6细胞中的ERK / JNK MAPK和PI3K / Akt磷酸化由于参与肝纤维化的MAPK信号通路的重要作用，我们分析了OPC对

15、JNK和ERK磷酸化的影响。 用OPC（5,10,20和40mg / ml）处理30分钟，我们发现LPS刺激后磷酸化的ERK和JNK显着增强，但是通过OPC处理和浓度有效地降低了这些MAPK蛋白的磷酸化水平 （图3）。 为了证实OPC的抗纤维化机制是否涉及PI3K / Akt信号通路，我们进行了磷酸化和总PI3K和Akt蛋白的Western印迹分析。 在LPS刺激的HSC-T6细胞中发生PI3K / Akt的磷酸化。 磷酸化PI3K / Akt蛋白水平通过OPC浓度依赖性降低。图2. OPC对LPS激活的HSC-T6细胞的肝纤维化标志物的影响。 HSC-T6细胞在LPS激活另外24小时之前用O

16、PC预处理1小时。 （A）使用western印迹检测a-SMA，胶原I和TIMP-1的蛋白表达。 （B）每个条带被数字化并归一化为b-肌动蛋白水平。 * P 0.001，与LPS激活的HSC-T6细胞相比有显着差异。 # P 0.001，与正常未处理的HSC-T6细胞相比有显着性差异。图3. LPS激活的HSC-T6细胞中的ERK / JNK MAPK和PI3K / Akt磷酸化。 HSC-T6细胞在LPS刺激前1小时预处理30分钟。 （A）通过用特异性一级抗体的Western印迹测量磷酸化和总JNK，ERK，PI3K和Akt蛋白。 （B）每个条带被数字化并归一化为b-肌动蛋白水平。 * P

17、0.001，与LPS激活的HSC-T6细胞相比有显着差异。 # P 0.001，与正常未处理的HSCT6细胞相比有显着性差异。3.3。 OPC阻断LPS刺激的HSCT6细胞中的NF-kB核移位NF-kB是LPS刺激的HSC-T6细胞中促炎介质生产中的关键上游调节因子。 我们调查了OPC是否可以阻止NFkB的核易位。 首先，使用western blot检测核和细胞溶质级分中的NF-kB p65亚基。 NF-kB p65在LPS刺激后30分钟内降低，而NF-kB p65表达增加（图4A和B）。 核和细胞质分数的这些变化表明，HSC中的LPS刺激后，NF-kB p65从胞质溶胶转移到核。 据预期，O

18、PC成功抑制了细胞质中NF-kB p65表达的降低，核增加。 我们还观察到LPS刺激后30分钟，NF-kB p65明显移位到HSC细胞核中（图4C）。 然而，与LPS引发的HSC-T6细胞相比，OPC预处理显着抑制NF-kB的核易位。3.4。 靶向PI3K / JNK / NF-kB信号抑制HSC-T6细胞的纤维形态表型图4. OPC对LPS诱导的NF-kB易位的影响。 HSC-T6细胞用LPS预处理1小时，然后再用LPS处理30分钟。 （A）通过western印迹测定核（Nu）和胞质（Cy）级分中的NF-kB p65。 （B）每个免疫反应带被数字化并表示为每个加载对照的比例。 （C）NF-k

19、B p65易位通过免疫荧光检测（放大倍数：200）在LPS激活的HSC-T6细胞中包括a-SMA和胶原蛋白I的ECM沉积的增加也通过免疫荧光证实（图5A和B）。 a-SMA和胶原I完全位于HSC-T6细胞的胞质溶胶中。 OPC预处理减少HSC-T6细胞中a-SMA和胶原I的阳性染色。 为了验证PI3K / JNK / NF-kB信号传导可以调节HSC的纤维形态，我们将NF-kB，PI3K和JNK的抑制剂预处理成LPS激活的HSC-T6细胞。 由于JSH23（NF-kB抑制剂）抑制了a-SMA和胶原I的荧光强度，Ly294002（PI3K抑制剂）和SP600125（JNK抑制剂）（图5A，5B，

20、5C和5D）。 通过OPC的-SMA和胶原I表达的相当程度等同于NF-kB，PI3K和JNK的抑制剂。 它暗示着靶向PI3K / JNK / NF-kB信号调控HSC激活和转分化，以及通过OPC对PI3K / JNK / NF-kB信号传导的抑制作用可能有助于HSC活化的抑制。4。讨论图5. a-SMA和胶原I对LPS激活的HSC-T6细胞的荧光分析。 在LPS激活前1小时，用OPC（20和40mg / ml），JSH23（NF-kB抑制剂，10mM），Ly294002（PI3K抑制剂，25mM）和SP600125（JNK抑制剂，20mM）预处理HSC-T6细胞 再过24小时。 然后用a-SM

21、A（A）和/或胶原I（B）免疫细胞。 显示a-SMA或胶原I染色（绿色）和具有40,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）的核。 图片拍摄于600？ 放大。 用Image Pro-Plus 6.0分析a-SMA（C）或胶原I（D）的绿色荧光强度。 * P 0.001，与LPS激活的HSC-T6细胞相比有显着差异。 # P 0.001，与未处理的HSC-T6细胞相比显着不同。肝纤维化是由长期肝脏疾病对慢性肝损伤的伤口愈合反应引起的，如果不能很好地控制，肝纤维化将发展为肝硬化，甚至是肝癌。 HSC是肝纤维化过程中ECM的关键生产者。持续的HSC活化导致肝纤维化。抑制HSC中过量的ECM合成是治

22、疗肝纤维化的众所周知的有吸引力的方法30,31。低分子原花青素（OPC），一类类黄酮化合物，广泛用于葡萄种子以及各种水果和蔬菜。 OPC被广泛用作对心脏恢复有积极作用的营养和膳食补充剂和肥胖32,33。另外，鉴于OPC在几种动物纤维化模型中改善动物肝纤维化，我们对OPC是否和如何调节HSC激活感兴趣。为了检测OPC是否可以降低激活的HSC的纤维化程度，我们研究了肝纤维化标记物的蛋白质表达。 a-SMA和胶原I代表纤维化过程中活化的HSC的典型纤维化标志物。 TIMP-1由HSC产生，可防止胶原蛋白降解，最终促进肝纤维化。目前的结果表明，肝纤维化标志物的蛋白质表达，例如A-SMA，胶原I和TIM

23、P-1，通过OPC显着降低，表明OPC可调节ECM代谢。结合细胞活力数据，上述结果表明，通过OPC降低的ECM累积可能与细胞活力降低部分相关，从而减轻HSC活化。 MAPKs是丝氨酸 - 苏氨酸蛋白激酶，可以被大多数细胞外刺激激活。 MAPKs介导NF-kB和PI3K / Akt信号转导。 MAPKs调节HSCs中的主要纤维化反应34。三种主要的MAPKs包括ERK，JNK和p38激酶。据报道，JNK活动将HSC增殖转化为细胞凋亡响应静止HSC刺激35。 ERK的激活上调NF-kB / AP-1转录因子的活性，导致HSC活化36。因此，靶向JNK和ERK的药物可能具有抗纤维化活性，可能是通过N

24、F-kB的抑制作用阻断肝纤维化进展的方法37。我们的数据证实ERK和JNK磷酸化在LPS激活后30分钟显着增加，并且正如预期的，通过OPC有效地降低了ERK和JNK的磷酸化水平。此外，我们的免疫印迹和免疫荧光染色图4. OPC对LPS诱导的NF-kB易位的影响。 HSC-T6细胞用LPS预处理1小时，然后再用LPS处理30分钟。 （A）通过western印迹测定核（Nu）和胞质（Cy）级分中的NF-kB p65。 （B）每个免疫反应带被数字化并表示为每个加载对照的比例。 （C）通过免疫荧光（倍率：200？）检测NF-kB p65易位。 678 M. Jiang et al。 /生物医药和药物治

25、疗93（2017）674-680分析证实，在30分钟内LPS激活的HSC发生NF-kB p65核易位，而OPC抑制LPS诱导的HSC中NF-kB亚基的核移位。 JNK和NF-kB的抑制剂成功地降低了位于HSC胞质溶胶中的-SMA，胶原I的表达。这些结果暗示OPC抑制JNK / ERK磷酸化和NF-kB p65激活，OPC表现出的这些抑制活性可能有助于抑制ECM在激活的HSC中的过度沉积。 PI3K是细胞内磷脂酰肌醇激酶，与各种细胞功能有关。 Akt是NF-kB的上游38，NF-kB过表达导致Akt磷酸化39。 PI3K / Akt信号传导的失调与肝纤维化有关。 PI3K /Akt信号转导也参与

26、ECM沉积，HSC活化和肝纤维化进展的调节。在目前的研究中，磷酸化PI3K / Akt在HSC-T6细胞中LPS刺激后高度增加，这与我们以前的结果一致24,25。如预期，OPC预处理成功抑制PI3K / Akt磷酸化。我们也证实PI3K抑制剂完全抑制了ECM的生成。这些数据表明，OPC的潜在抗纤维化机制可能涉及通过抑制PI3K / Akt信号来阻断NF-kB活化。我们的研究结果表明靶向PI3K / AktMAPK-NF-kB信号可能调节HSC-T6细胞的纤维形态表型，实际上OPC通过NF-kB调控触发了PI3K / Akt和MAPK信号传导之间的复杂串扰。然而，进一步的研究需要确定OPC在已建立的肝纤维化动物模型中的体内治疗作用。总之，OPC通过降低ECM沉积来抑制HSC活化，并且该抗纤维化活性可能由MAPK和PI3K / Akt通过NF-kB调节介导。因此OPC具有抑制MAPK和PI3K / AKT途径以预防肝纤维化的潜在治疗益处。总之，OPC的这种抗纤维化机制可能与通过激活的HSC中的NF-kB调节的MAPK和PI3K / Akt的调节相关，OPC可能是治疗肝纤维化的潜在天然候选物。