从葡萄籽中提取的寡聚原花青素在激活的肝星状细胞中抑制NFkB信号传导.docx

从葡萄籽中提取的寡聚原花青素在激活的肝星状细胞中抑制NFkB信号传导.docx

《从葡萄籽中提取的寡聚原花青素在激活的肝星状细胞中抑制NFkB信号传导.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《从葡萄籽中提取的寡聚原花青素在激活的肝星状细胞中抑制NFkB信号传导.docx（8页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

从葡萄籽中提取的寡聚原花青素在激活的肝星状细胞中抑制NFkB信号传导

从葡萄籽中提取的寡聚原花青素在激活的肝星状细胞中抑制NFkB信号传导:

参与JNK/ERKMAPK和PI3K/Akt通路

在本研究中，我们旨在揭示葡萄籽中低聚原花青素（OPC）对脂多糖（LPS）活化，HSC-T6，大鼠肝星状细胞系的潜在抗纤维化作用.。

HSC-T6细胞在加入LPS前用OPC处理1小时，然后在指定时间内孵育。

OPC抑制HSC-T6细胞的细胞活力，并减少在lps诱导的HSC-T6细胞中胶原蛋白I，α-平滑肌肌动蛋白（a-SMA），金属蛋白酶I（TIMP-1）组织抑制剂在LPS诱导的蛋白表达。

OPC还显着抑制LPS刺激的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K），蛋白激酶B（Akt），细胞外信号调节激酶（ERK）和c-JunN-末端激酶（JNK）的磷酸化。

此外，OPC预处理阻止LPS-引发的核因子κB（NF-kB）从细胞质转移到核。

OPC，以及NF-kB，PI3K和JNK的特异性抑制剂可以有效抑制α-SMA和胶原蛋白I的表达。

总之，我们证实了OPC的抗纤维化机制可能通过JNK/ERKMAPK和PI3K/Akt磷酸化抑制NF-kB的活化来参与HSC活化和转分化的抑制。

因此，OPC通过涉及MAPK-PI3K/AKT途径的NF-kB调节具有HSC活化的潜在抑制性质。

1.介绍

肝纤维化是慢性肝炎的常见病理结果，最终会导致肝硬化甚至肝癌。

肝纤维化进展的特点是细胞外基质过多（ECM）沉积，包括胶原蛋白I和平滑肌肌动蛋白（a-sma）[1]。

活化的肝星状细胞（HSC）在肝纤维化中起着关键作用，所以控制肝星状细的活化是抗纤维化治疗的理想靶点。

[2]通过不同的刺激，静止的肝星状细胞被激活和分化，然后由肝星状细胞产生的大量的细胞外基质（ECM）沉积于纤维组织[3,4]。

在HSC激活过程中，ECM定量地和定性地增加。

这些过度的ECM导致了ECM降解与生成的不平衡。

因此，抑制HSC的增殖和活化是一种理想肝纤维化的治疗方法。

脂多糖（LPS），革兰氏阴性细菌的主要细胞壁成分，是toll样受体4（TLR4）的主要配体，在许多类型的肝细胞中表达，包括Kupffer细胞，肝细胞和HSCs。

特别是,TLR4在HSC中的表达在肝纤维化中起关键作用[5]。

肝损伤后,肠粘膜渗透性增加，导致内毒素易位增加[6]。

虽然库普弗细胞是LPS的最佳表征靶点，但HSC也对低浓度的肠源性内毒素具有高度的反应[7]。

在人肝标本分离的活化HSC中也观察到LPS诱导的核因子-κB（NF-kB）活化[8]。

NF-kB在HSC活化和纤维发生的进程中起关键作用[9]nf-kb是二聚体转录因子家族，在肝纤维化的发展过程中起着核心作用[10]。

nf-kb激活发生在活化的HSCs中，nf-kb抑制剂可以有效阻断小鼠肝纤维化[11]。

因此，阻断nf-kb信号通路可以抑制HSC激活，进而减弱肝纤维化。

磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/Akt通路可增强NF-kB的转录活性[12]丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI3K/蛋白激酶B（AKT）之间的串扰可能会调节细胞存活[13]JNK，PI3K和Akt的激活诱导具有促纤维化作用的HSC的激活[14,15]。

已经使用药理学或遗传学方法建立了对HSC中PI3K/Akt信号传导的抑制，从而抑制HSC的激活[16]。

因此，通过MAPK和PI3K/Akt途径靶向NF-kB的新药物和方法可能有益于阻断肝纤维化进展。

因此，通过MAPK和PI3K/Akt途径靶向NF-kB的新药物和方法可能有益于阻断肝纤维化进展。

低分子原花青素复合物（OPC，也称为原花青素），一类类黄酮化合物，通常从葡萄籽以及各种水果和蔬菜中获得，具有有效和广泛的药理和治疗活性[17]。

OPC是一种高分子量的聚合物，包括原花青素，原花翠素类和花葵素[18]。

OPC是功能强大的抗氧化剂，可以摆脱自由基。

丰富的体内科学证据表明，OPC防护小鼠酒精-四氯化碳-，二甲基亚硝胺-或硫代乙酰胺-诱导的肝纤维化[19-22]。

来自蓝莓V.virgatum的叶片的原花青素阻断了血小板衍生生长因子（PDGF）诱导的人类HSC活化[23]，表明OPC可能是肝纤维化的潜在治疗剂。

然而，OPC在抑制通过MAPK和PI3K/Akt信号传导的HSC活化的确切机制迄今尚未得到充分阐明。

在目前的研究中，我们利用LPS激活的HSC体外模型来研究OPC的潜在抗纤维化作用。

我们的数据表明OPC通过在纤维化过程中抑制NF-kB活化来抑制HSC转分化，并且这些事件可能由ERK/JNKMAPK和PI3K/Akt途径介导。

2.材料和方法

2.1材料

来自于伊方科技有限公司（中国天津）的葡萄籽中的OPC（纯度>99.80％）。

LPS和二甲基亚砜（DMSO）购自SigmaChemicalsCo.（StLouis，MO，美国）。

OPC溶解于DMSO中，细胞DMSO浓度小于0.5％，不影响细胞生长[24]。

抗PI3K，抗磷酸化PI3K，抗Akt和抗磷酸化Akt抗体购自CellSignalingTechnology（Beverly，MA，USA）。

抗NF-kBp65和抗TopoI抗体购自SantaCruzBiotechnologyInc.（Dallas，Texas，USA）。

抗肌动蛋白和抗-α-SMA抗体购自Abcam（Cambridge，MA，USA）。

JSH23（NF-kB抑制剂），Ly294002（PI3K抑制剂）和SP600125（JNK抑制剂）购自Sigma-Aldrich。

BCA蛋白测定试剂盒购自BeyotimeInst。

生物技术。

（中国江苏）。

所有细胞培养物均购自FischerScientific。

2.2细胞培养

将HSC-T6细胞在含有5％CO2-95％空气的湿润培养箱中，在含有10％胎牛血清（FBS），100单位/ml青霉素G钠和100mg/ml链霉素的DMEM中培养。

HSC-T6是永生化的大鼠肝星状细胞系，具有原代HSC的特异性表型和功能。

2.3通过MTT法测定细胞活力

使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基咔唑溴化物（MTT）测定法测量细胞活力。

将HSC-T6细胞以1×104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在存在或不存在OPC的条件下处理24小时。

加入MTT，然后再培养3小时。

抽出含有MTT的培养基，用DMSO代替。

使用酶标仪在540nm检测MTT对紫色番茄的减少。

2.4。

蛋白质印迹分析

从HSC-T6细胞中提取总蛋白，用Western和IP的裂解缓冲液提取，用核和细胞质蛋白提取试剂盒（中国江苏省生物技术研究所）制备核和胞质提取物。

通过8-12％的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离等量的蛋白质，然后转移到PVDF膜。

并用含有5％脱脂乳和0.05％吐温20的PBS封闭膜，然后与特异性一级抗体一起温育，随后与HRP-缀合的二抗孵育。

最后，用增强型化学发光（ECL）检测系统（Beyotime，Nanjing，Jiangsu，China）显现目标蛋白，并暴露于X射线胶片。

用Bio-RadQuantityOne软件分析每个条带的密度。

b-肌动蛋白用作加载对照。

2.5。

免疫细胞化学染色

细胞在6孔板中的盖玻片上生长，然后在不存在或存在LPS的情况下用OPC处理。

细胞用4％多聚甲醛固定，然后在0.1％TritonX-100中透化，然后用PBS中10％山羊血清封闭。

之后，将细胞在第一抗体中在4℃下孵育过夜，然后进行FITC-缀合的第二抗体孵育。

用含有DAPI（Abcam）的荧光载体培养基安装细胞，然后将OlympusBX53荧光显微镜或OlympusFluoViewTMFV10i共焦激光扫描生物显微镜显像。

2.6。

统计分析

数据以平均值表示？

标准差（SD）。

通过单因素方差分析（ANOVA）评估统计学意义。

显着性水平（P值）小于0.05。

所有统计分析均使用GraphPadPrismv6软件（GraphpadSoftwareInc.，USA）进行。

3.结果

3.1。

OPC抑制LPS激活的HSC-T6细胞的肝纤维化标志物

首先，我们确定了HSC-T6细胞的活力。

OPC（0-40mg/ml）在24小时内浓度依赖性降低HSC-T6细胞活力（图1A）。

OPC的IC50为54.20mg/ml。

LPS统计增加HSC-T6细胞活力，这与以前的报道一致[25,26]，表明LPS可以刺激HSC的活化。

在LPS存在下用OPC处理的HSC-T6细胞也表现出细胞活力下降的趋势（图1B）。

据报道姜黄素通过抑制HSC活化来保护肝纤维化，并且对治疗肝纤维化具有很高的治疗意义[27,28]。

正在进行一系列临床研究以研究姜黄素对人类肝脏疾病的影响（www.ClinicalTrials.gov）。

因此，我们使用姜黄素作为阳性对照，我们也在以前的研究中使用姜黄素作为阳性对照[29]。

OPC在20和40mg/ml的共振中表现出与HSC-T6细胞中的姜黄素相当的细胞毒性，表明OPC具有HSC活力的潜在抑制特性。

为了证实OPC的抗纤维化作用，我们确定蛋白M.Giang等。

通过蛋白质印迹法分析胶原蛋白I，SMA和TIMP-1的表达.LPS处理增加肝纤维化标志物，如胶原I，a-SMA和TIMP-1，而用OPC预处理在LPS治疗之前，以浓度依赖性方式抑制LPS诱导的肝纤维化标志物蛋白表达增加（图2A和2B）。

我们的数据证实，通过OPC抑制ECM生成可能与降低的HSC增殖有关。

图1.OPC对HSC-T6细胞活力的影响。

在不存在（A）或存在（B）LPS的情况下，用不同浓度的OPC或姜黄素预处理HSC-T6细胞24小时。

＃P<0.5，###P<0.001，与未处理的HSC-T6细胞相比有明显差异;***P<0.001，与LPS处理的HSC-T6细胞相比显着不同。

3.2。

OPC抑制激活的HSC-T6细胞中的ERK/JNKMAPK和PI3K/Akt磷酸化

由于参与肝纤维化的MAPK信号通路的重要作用，我们分析了OPC对JNK和ERK磷酸化的影响。

用OPC（5,10,20和40mg/ml）处理30分钟，我们发现LPS刺激后磷酸化的ERK和JNK显着增强，但是通过OPC处理和浓度有效地降低了这些MAPK蛋白的磷酸化水平（图3）。

为了证实OPC的抗纤维化机制是否涉及PI3K/Akt信号通路，我们进行了磷酸化和总PI3K和Akt蛋白的Western印迹分析。

在LPS刺激的HSC-T6细胞中发生PI3K/Akt的磷酸化。

磷酸化PI3K/Akt蛋白水平通过OPC浓度依赖性降低。

图2.OPC对LPS激活的HSC-T6细胞的肝纤维化标志物的影响。

HSC-T6细胞在LPS激活另外24小时之前用OPC预处理1小时。

（A）使用western印迹检测a-SMA，胶原I和TIMP-1的蛋白表达。

（B）每个条带被数字化并归一化为b-肌动蛋白水平。

***P<0.001，与LPS激活的HSC-T6细胞相比有显着差异。

###P<0.001，与正常未处理的HSC-T6细胞相比有显着性差异。

图3.LPS激活的HSC-T6细胞中的ERK/JNKMAPK和PI3K/Akt磷酸化。

HSC-T6细胞在LPS刺激前1小时预处理30分钟。

（A）通过用特异性一级抗体的Western印迹测量磷酸化和总JNK，ERK，PI3K和Akt蛋白。

（B）每个条带被数字化并归一化为b-肌动蛋白水平。

***P<0.001，与LPS激活的HSC-T6细胞相比有显着差异。

###P<0.001，与正常未处理的HSCT6细胞相比有显着性差异。

3.3。

OPC阻断LPS刺激的HSCT6细胞中的NF-kB核移位

NF-kB是LPS刺激的HSC-T6细胞中促炎介质生产中的关键上游调节因子。

我们调查了OPC是否可以阻止NFkB的核易位。

首先，使用westernblot检测核和细胞溶质级分中的NF-kBp65亚基。

NF-kBp65在LPS刺激后30分钟内降低，而NF-kBp65表达增加（图4A和B）。

核和细胞质分数的这些变化表明，HSC中的LPS刺激后，NF-kBp65从胞质溶胶转移到核。

据预期，OPC成功抑制了细胞质中NF-kBp65表达的降低，核增加。

我们还观察到LPS刺激后30分钟，NF-kBp65明显移位到HSC细胞核中（图4C）。

然而，与LPS引发的HSC-T6细胞相比，OPC预处理显着抑制NF-kB的核易位。

3.4。

靶向PI3K/JNK/NF-kB信号抑制HSC-T6细胞的纤维形态表型

图4.OPC对LPS诱导的NF-kB易位的影响。

HSC-T6细胞用LPS预处理1小时，然后再用LPS处理30分钟。

（A）通过western印迹测定核（Nu）和胞质（Cy）级分中的NF-kBp65。

（B）每个免疫反应带被数字化并表示为每个加载对照的比例。

（C）NF-kBp65易位通过免疫荧光检测（放大倍数：

200）

在LPS激活的HSC-T6细胞中包括a-SMA和胶原蛋白I的ECM沉积的增加也通过免疫荧光证实（图5A和B）。

a-SMA和胶原I完全位于HSC-T6细胞的胞质溶胶中。

OPC预处理减少HSC-T6细胞中a-SMA和胶原I的阳性染色。

为了验证PI3K/JNK/NF-kB信号传导可以调节HSC的纤维形态，我们将NF-kB，PI3K和JNK的抑制剂预处理成LPS激活的HSC-T6细胞。

由于JSH23（NF-kB抑制剂）抑制了a-SMA和胶原I的荧光强度，Ly294002（PI3K抑制剂）和SP600125（JNK抑制剂）（图5A，5B，5C和5D）。

通过OPC的α-SMA和胶原I表达的相当程度等同于NF-kB，PI3K和JNK的抑制剂。

它暗示着靶向PI3K/JNK/NF-kB信号调控

HSC激活和转分化，以及通过OPC对PI3K/JNK/NF-kB信号传导的抑制作用可能有助于HSC活化的抑制。

4。

讨论

图5.a-SMA和胶原I对LPS激活的HSC-T6细胞的荧光分析。

在LPS激活前1小时，用OPC（20和40mg/ml），JSH23（NF-kB抑制剂，10mM），Ly294002（PI3K抑制剂，25mM）和SP600125（JNK抑制剂，20mM）预处理HSC-T6细胞再过24小时。

然后用a-SMA（A）和/或胶原I（B）免疫细胞。

显示a-SMA或胶原I染色（绿色）和具有40,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）的核。

图片拍摄于600？

放大。

用ImagePro-Plus6.0分析a-SMA（C）或胶原I（D）的绿色荧光强度。

***P<0.001，与LPS激活的HSC-T6细胞相比有显着差异。

###P<0.001，与未处理的HSC-T6细胞相比显着不同。

肝纤维化是由长期肝脏疾病对慢性肝损伤的伤口愈合反应引起的，如果不能很好地控制，肝纤维化将发展为肝硬化，甚至是肝癌。

HSC是肝纤维化过程中ECM的关键生产者。

持续的HSC活化导致肝纤维化。

抑制HSC中过量的ECM合成是治疗肝纤维化的众所周知的有吸引力的方法[30,31]。

低分子原花青素（OPC），一类类黄酮化合物，广泛用于葡萄种子以及各种水果和蔬菜。

OPC被广泛用作对心脏恢复有积极作用的营养和膳食补充剂

和肥胖[32,33]。

另外，鉴于OPC在几种动物纤维化模型中改善动物肝纤维化，我们对OPC是否和如何调节HSC激活感兴趣。

为了检测OPC是否可以降低激活的HSC的纤维化程度，我们研究了肝纤维化标记物的蛋白质表达。

a-SMA和胶原I代表纤维化过程中活化的HSC的典型纤维化标志物。

TIMP-1由HSC产生，可防止胶原蛋白降解，最终促进肝纤维化。

目前的结果表明，肝纤维化标志物的蛋白质表达，例如A-SMA，胶原I和TIMP-1，通过OPC显着降低，表明OPC可调节ECM代谢。

结合细胞活力数据，上述结果表明，通过OPC降低的ECM累积可能与细胞活力降低部分相关，从而减轻HSC活化。

MAPKs是丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，可以被大多数细胞外刺激激活。

MAPKs介导NF-kB和PI3K/Akt信号转导。

MAPKs调节HSCs中的主要纤维化反应[34]。

三种主要的MAPKs包括ERK，JNK和p38激酶。

据报道，JNK活动将HSC增殖转化为细胞凋亡响应静止HSC刺激[35]。

ERK的激活上调NF-kB/AP-1转录因子的活性，导致HSC活化[36]。

因此，靶向JNK和ERK的药物可能具有抗纤维化活性，可能是通过NF-kB的抑制作用阻断肝纤维化进展的方法[37]。

我们的数据证实ERK和JNK磷酸化在LPS激活后30分钟显着增加，并且正如预期的，通过OPC有效地降低了ERK和JNK的磷酸化水平。

此外，我们的免疫印迹和免疫荧光染色图4.OPC对LPS诱导的NF-kB易位的影响。

HSC-T6细胞用LPS预处理1小时，然后再用LPS处理30分钟。

（A）通过western印迹测定核（Nu）和胞质（Cy）级分中的NF-kBp65。

（B）每个免疫反应带被数字化并表示为每个加载对照的比例。

（C）通过免疫荧光（倍率：

200？

）检测NF-kBp65易位。

678M.Jiangetal。

/生物医药和药物治疗93（2017）674-680分析证实，在30分钟内LPS激活的HSC发生NF-kBp65核易位，而OPC抑制LPS诱导的HSC中NF-kB亚基的核移位。

JNK和NF-kB的抑制剂成功地降低了位于HSC胞质溶胶中的α-SMA，胶原I的表达。

这些结果暗示OPC抑制JNK/ERK磷酸化和NF-kBp65激活，OPC表现出的这些抑制活性可能有助于抑制ECM在激活的HSC中的过度沉积。

PI3K是细胞内磷脂酰肌醇激酶，与各种细胞功能有关。

Akt是NF-kB的上游[38]，NF-kB过表达导致Akt磷酸化[39]。

PI3K/Akt信号传导的失调与肝纤维化有关。

PI3K/Akt信号转导也参与ECM沉积，HSC活化和肝纤维化进展的调节。

在目前的研究中，磷酸化PI3K/Akt在HSC-T6细胞中LPS刺激后高度增加，这与我们以前的结果一致[24,25]。

如预期，OPC预处理成功抑制PI3K/Akt磷酸化。

我们也证实PI3K抑制剂完全抑制了ECM的生成。

这些数据表明，OPC的潜在抗纤维化机制可能涉及通过抑制PI3K/Akt信号来阻断NF-kB活化。

我们的研究结果表明靶向PI3K/AktMAPK-NF-kB信号可能调节HSC-T6细胞的纤维形态表型，实际上OPC通过NF-kB调控触发了PI3K/Akt和MAPK信号传导之间的复杂串扰。

然而，进一步的研究需要确定OPC在已建立的肝纤维化动物模型中的体内治疗作用。

总之，OPC通过降低ECM沉积来抑制HSC活化，并且该抗纤维化活性可能由MAPK和PI3K/Akt通过NF-kB调节介导。

因此OPC具有抑制MAPK和PI3K/AKT途径以预防肝纤维化的潜在治疗益处。

总之，OPC的这种抗纤维化机制可能与通过激活的HSC中的NF-kB调节的MAPK和PI3K/Akt的调节相关，OPC可能是治疗肝纤维化的潜在天然候选物。