1、泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1DEPC过夜,再烤干)3、匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需要泡DEPC)三、试剂配制:1、DEPC水:吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。2、75%乙醇:用无水乙醇 DEPC水配,然后放-20保存(其中DEPC水需先高压)3、异丙醇:放入棕色瓶中4、氯仿:5、琼脂糖二总RNA提取1. 取100mg组织,放到1.5mlEP管中,加入1mlTrizol剪碎。(1)液氮研磨,组织块直接放入研钵中,加入少量液氮,迅速研磨,待组织变软,再加少量液氮,再研磨,如此三次,按
2、 50-100mg 组织/ml Trizol 加入 Trizol,转入离心管进行第 2 步操作。(2) 匀浆:组织样品按 50-100mg/mlTrizol 加入 Trizol。另外,组织体积不能超过 Trizol 体积的 10%,否则匀浆效果会不好,用电动匀浆器充分匀浆约需 1-2 分钟。2. 震荡30s,室温放置 5min,使其充分裂解。12,000rpm 离心 5min,弃沉淀。3. 加0.2ml氯仿,摇动30s,室温5-10min。注:禁用漩涡振荡器,以免基因组 DNA 断裂。4. 12000g,4离心,15min。5. 吸上层无色水相,移入另一EP管中(约0.5ml)。6. 加等体积
3、异丙醇,室温放置 5-10min。7. 12000g,4离心,10min。在管底部可见微量RNA沉淀8. 弃上清,加冰预冷75%乙醇1ml,温和振荡,悬浮沉淀。9. 800010. 弃上清,用滤纸小心吸取残留液体,室温干燥5-10min。11. 沉淀溶于20lDEPC水(可用20ul H2O,TE buffer或 0.5%SDS溶解RNA样品,55-60,5-10min。H2O、TE或 0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。),取1l加入79lDEPC水测OD260/OD28012. 计算浓度与纯度,-70保存。三、逆转录合成cDNA第一链反应体系如下总体系20l约3gRNA量+1l Oligo dT+water=12l5*RTbuffer 4ldNTP 2lRNase inhibitor 1lAMV Reverse Transpase 1l温度42 1小时冰上配制混匀快速离心一次反应条件如下-20 冰箱冻存四、PCR反应混匀快速离心一次PCR产物-20冰箱保存取PCR产物8l 加5Loading Buffer 2l 2%琼脂糖凝胶电泳120V。100mA 30min 溴化乙锭染色,凝胶成象仪成象并保存结果。