RT-PCR全过程步骤Word文档格式.docx

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泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）

3、匀浆器：

（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）

三、试剂配制：

1、DEPC水：

吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。

2、75%乙醇：

用无水乙醇DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）

3、异丙醇：

放入棕色瓶中

4、氯仿：

5、琼脂糖

二．总RNA提取

1.取100mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。

（1）液氮研磨，组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/mlTrizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。

（2）匀浆：

组织样品按50-100mg/mlTrizol加入Trizol。

另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。

2.震荡30s，室温放置5min，使其充分裂解。

12,000rpm离心5min，弃沉淀。

3.加0.2ml氯仿，摇动30s，室温5-10min。

注：

禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。

4.12000×

g，4℃离心，15min。

5.吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。

6.加等体积异丙醇，室温放置5-10min。

7.12000×

g，4℃离心，10min。

在管底部可见微量RNA沉淀

8.弃上清，加冰预冷75%乙醇1ml，温和振荡，悬浮沉淀。

9.8000×

10.弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。

11.沉淀溶于20μlDEPC水（可用20ulH2O，TEbuffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。

H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。

），取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280

12.计算浓度与纯度，-70℃保存。

三、逆转录合成cDNA第一链

反应体系如下

总体系20μl

约3μgRNA量+1μlOligodT+water=12μl

5*RTbuffer4μl

dNTP2μl

RNaseinhibitor1μl

AMVReverseTranspase1μl

温度42℃1小时

冰上配制混匀快速离心一次

反应条件如下

-20℃冰箱冻存

四、PCR反应

混匀快速离心一次

PCR产物-20℃冰箱保存

取PCR产物8μl加5×

LoadingBuffer2μl2%琼脂糖凝胶电泳120V。

100mA30min溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。