毛细管区带电泳分离烟草中的生物碱Word文件下载.doc

1、烟草生物碱能在烟气中形成特有的致癌亚硝胺1-3，如图1中的NNK和NNN，所以有必要对烟草中的烟碱和其它生物碱进行分离和测定。已报导的烟草生物碱分离测定方法有气相色谱和液相色谱法。毛细管电泳具有简易、快速、高效和低成本等特点。烟草生物碱的毛细管电泳分离已有报导4, 5，该方法采用磷酸缓冲体系，用毛细管区带电泳和胶束电动毛细管色谱法分别分离了3种和5种烟草生物碱。根据我们的实验结果，磷酸缓冲体系不能将米渥斯明与其它烟草生物碱分离。本文采用酒石酸缓冲体系的毛细管区带电泳法，可使4-5种烟草生物碱达到基线分离。不仅分离度改善，而且吸收峰增大，优于已报导的方法4, 5。2 实验部分2.1仪器和试剂12

2、29型毛细管电泳仪（北京新技术应用研究所），检测波长254 nm。N-2000双通道色谱工作站（浙江大学智能信息工程研究所）。S-2200超声波清洗器（35 kHz, 120 W, 上海杰理科技公司）。50 mm i.d.石英毛细管总长60 cm, 有效长度45 cm（河北永年锐沣色谱器件公司）。所用试剂均为分析纯，实验溶液用去离子水配制（合肥科生公司）。烟碱、去甲基烟碱、假木贼碱和米渥斯明购自Sigma （USA）。缓冲液为360 mmol/L酒石酸用5 mol/L NaOH调至pH 3.2。2.2 实验方法2.2.1 毛细管电泳分离 每天使用前分离毛细管用下列试剂顺序冲洗：1.0 mol/

3、L盐酸，5 min；去离子水，1 min,；1.0 mol/L氢氧化钠，15 min；去离子水，1 min；再用缓冲溶液平衡10 min。样品分离之间用缓冲液冲洗2 min。先4 kV电动引入水塞10 s, 再4 kV电动进样50 s。电泳电压12 kV。2.2.2 样品处理 称取40 烘干4 h、碾磨并过40目筛的烟叶样品0.010 g于100 mL带塞锥形瓶中, 加入50 mL去离子水，盖塞超声15 min。混合液经离心, 2000 rpm, 2 min。上清液冰箱冷藏，供检测使用。3 结果与讨论3.1 电泳缓冲液的选择采用磷酸和酒石酸缓冲体系对烟碱（nicotine）、去甲基烟碱 （no

4、rnicotine）、米喔斯明（myosmine） 和假木贼碱 （anabasine）的混合标准溶液进行分离，见图2。经分离条件优化后，酒石酸缓冲体系不仅分离度改善，而且峰高增加。原因可能是分子间的配位作用增强了共轭p键。磷酸缓冲体系中未见米渥斯明的分离峰。图2 不同缓冲体系的烟草生物碱电泳图. Fig.2 Electropherograms of tobacco alkaloids with different buffer systems.A: pH 2.2, 100 mmol/L phosphate buffer solution. B: pH 3.2, 360 mmol/L tarta

5、ric acid buffer solution. Sample solution is injected at 4 kV for 10 s, electrophoretic voltage is 12 kV. 1, 0.9 mg/L nornicotine; 2, 1.1 mg/L nicotine; 3, 0.5 mg/L myosmine and 4, 0.6 mg/L anabasine.3.2 缓冲溶液pH值对烟草生物碱分离度的影响采用360 mmol/L酒石酸缓冲溶液时，不同pH的毛细管电泳分离见图4。低pH时，去甲基烟碱和烟碱的分离度较好，但米渥斯明未能基线分离高pH时，去甲基烟

6、碱和烟碱不能基线分离。pH 3.2的分离效率和分离度较佳，选定酒石酸缓冲溶液pH值为3.2。图4 烟草生物碱在不同pH缓冲液中的电泳谱图. Fig. 4 Electropherograms of tobacco alkaloids with different pH tartaric buffer solutions.360 mmol/L tartaric acid buffer solution Sample injection voltage is 4 kV for 30 s, electrophoretic voltage is 12 kV. 1, 0.9 mg/L nornicotin

7、e;3.3 酒石酸缓冲液浓度对烟草生物碱分离度的影响在pH值为3.2时, 对缓冲溶液浓度实验的结果见表1。缓冲溶液浓度为360 mmol/L时分离度最好。缓冲溶液浓度低于360 mmol/L时，米渥斯明与假木贼碱分不开；高于360 mmol/L时，去甲基烟碱与烟碱又不能基线分离。在烟草生物碱的电泳分离中，为提高缓冲容量一般选用较高浓度缓冲液，本文选360 mmol/L。3.4 样品分析中的阳离子耗尽富集法在烟草样品分析中，要检测比烟碱含量低得多的米渥斯明，必须加大进样量。而进样量增大又会降低分离度，特别是紧靠烟碱的去甲基烟碱。在进样前加一小段适当长的水塞，具有堆积作用，即阳离子耗尽富集法，会使

8、分离样品富集，谱峰更尖锐，分离度改善。固定进水塞时间分别为0, 10, 20和30 s，考察进样时间20, 40和60 s对米渥斯明峰高和去甲基烟碱与烟碱之间的分离度的影响。图5表明米渥斯明的峰高总是随进样时间的延长而增大，但随进水时间的变化却有一个最佳时间 10 s。图 5 米渥斯明的峰高随进水时间和进样时间的变化Fig 5 Effect of injection times of water plug and sample solution on peak height of myosmine.图6说明去甲基烟碱与烟碱间的分离度随进样时间的延长而降低, 进样时间超过50 s，分离度均小于1

9、。进水时间有一个最佳值10 s。综上所述，优化后的进水时间为10 s，进样时间为50 s。图6 去甲基烟碱与烟碱之间的分离度随进水时间和进样时间的变化Fig. 6 Effect of injection time of water and standard solution on resolution between nornicotine and nicotine.3.5分离与定性电泳电压也会影响实际烟草样品的生物碱分离。由于烟碱浓度高，去甲烟碱不易与烟碱分离。电泳电压12 kV时，可使去甲烟碱与烟碱基线分离。在上述优化条件下，实际样品的分离图谱见图7。将标准峰的相对保留时间（即其它烟碱保留

10、时间对烟碱保留时间的比值）与实际样品峰的相对保留时间比较, 分离物即可得到确认。图7实际样品的分离谱图Fig.7 electrophorogram of tobacco sampleReferences1 Xin Huijun （辛惠君）, Xie Fuwei（谢复炜）, Deng Dajun（邓大君）. Chinese Journal of Analytical Chemistry（分析化学）, 2000, 48（4）:436-438 2 Hecht S S. Mutation Research, 1999, 424: 127-1423 Kleinsasser N H, Wallner B

11、C, Harreus U A, Zwickenpflug W, Richter E. Toxicology, 2003, 192: 171-1774 Yang S S and Smetena I. Chromatographia., 1995, 40:375-3785 Yang S S, Smetena I, Goldsmith A I. Journal of Chromatography A, 1996, 746:131-136Abstract There has been very little published with respect to the separation of myo

12、smine and other alkaloids in tobacco with capillary electrophoresis using a phosphate buffer.In this work,we have developed a new electrolyte system for the separation of the tobacco alkaloids with capillary electrophoresis. which is capable of resolving myosmine and other alkaloids in tobacco. We found a highly concentrated tartaric buffer at low pH provided higher separation efficiency and higher sensitivity compared to phosphate buffer. Application of cation exhaust concentration to detection of minor alkaloids in tobacco was discussed .6