毛细管区带电泳分离烟草中的生物碱Word文件下载.doc

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烟草生物碱能在烟气中形成特有的致癌亚硝胺[1-3]，如图1中的NNK和NNN，所以有必要对烟草中的烟碱和其它生物碱进行分离和测定。

已报导的烟草生物碱分离测定方法有气相色谱和液相色谱法。

毛细管电泳具有简易、快速、高效和低成本等特点。

烟草生物碱的毛细管电泳分离已有报导[4,5]，该方法采用磷酸缓冲体系，用毛细管区带电泳和胶束电动毛细管色谱法分别分离了3种和5种烟草生物碱。

根据我们的实验结果，磷酸缓冲体系不能将米渥斯明与其它烟草生物碱分离。

本文采用酒石酸缓冲体系的毛细管区带电泳法，可使4-5种烟草生物碱达到基线分离。

不仅分离度改善，而且吸收峰增大，优于已报导的方法[4,5]。

2实验部分

2.1仪器和试剂

1229型毛细管电泳仪（北京新技术应用研究所），检测波长254nm。

N-2000双通道色谱工作站（浙江大学智能信息工程研究所）。

S-2200超声波清洗器（35kHz,120W,上海杰理科技公司）。

50mmi.d.石英毛细管总长60cm,有效长度45cm（河北永年锐沣色谱器件公司）。

所用试剂均为分析纯，实验溶液用去离子水配制（合肥科生公司）。

烟碱、去甲基烟碱、假木贼碱和米渥斯明购自Sigma（USA）。

缓冲液为360mmol/L酒石酸用5mol/LNaOH调至pH3.2。

2.2实验方法

2.2.1毛细管电泳分离每天使用前分离毛细管用下列试剂顺序冲洗：

1.0mol/L盐酸，5min；

去离子水，1min,；

1.0mol/L氢氧化钠，15min；

去离子水，1min；

再用缓冲溶液平衡10min。

样品分离之间用缓冲液冲洗2min。

先4kV电动引入水塞10s,再4kV电动进样50s。

电泳电压12kV。

2.2.2样品处理称取40℃烘干4h、碾磨并过40目筛的烟叶样品0.010g于100mL带塞锥形瓶中,加入50mL去离子水，盖塞超声15min。

混合液经离心,2000rpm,2min。

上清液冰箱冷藏，供检测使用。

3结果与讨论

3.1电泳缓冲液的选择

采用磷酸和酒石酸缓冲体系对烟碱（nicotine）、去甲基烟碱（nornicotine）、米喔斯明（myosmine）和假木贼碱（anabasine）的混合标准溶液进行分离，见图2。

经分离条件优化后，酒石酸缓冲体系不仅分离度改善，而且峰高增加。

原因可能是分子间的配位作用增强了共轭p键。

磷酸缓冲体系中未见米渥斯明的分离峰。

图2不同缓冲体系的烟草生物碱电泳图.

Fig.2Electropherogramsoftobaccoalkaloidswithdifferentbuffersystems.

A:

pH2.2,100mmol/Lphosphatebuffersolution.B:

pH3.2,360mmol/Ltartaricacidbuffersolution.Samplesolutionisinjectedat4kVfor10s,electrophoreticvoltageis12kV.1,0.9mg/Lnornicotine;

2,1.1mg/Lnicotine;

3,0.5mg/Lmyosmineand4,0.6mg/Lanabasine.

3.2缓冲溶液pH值对烟草生物碱分离度的影响采用360mmol/L酒石酸缓冲溶液时，不同pH的毛细管电泳分离见图4。

低pH时，去甲基烟碱和烟碱的分离度较好，但米渥斯明未能基线分离高pH时，去甲基烟碱和烟碱不能基线分离。

pH3.2的分离效率和分离度较佳，选定酒石酸缓冲溶液pH值为3.2。

图4烟草生物碱在不同pH缓冲液中的电泳谱图.

Fig.4ElectropherogramsoftobaccoalkaloidswithdifferentpHtartaricbuffersolutions.

360mmol/LtartaricacidbuffersolutionSampleinjectionvoltageis4kVfor30s,electrophoreticvoltageis12kV.1,0.9mg/Lnornicotine;

3.3酒石酸缓冲液浓度对烟草生物碱分离度的影响

在pH值为3.2时,对缓冲溶液浓度实验的结果见表1。

缓冲溶液浓度为360mmol/L时分离度最好。

缓冲溶液浓度低于360mmol/L时，米渥斯明与假木贼碱分不开；

高于360mmol/L时，去甲基烟碱与烟碱又不能基线分离。

在烟草生物碱的电泳分离中，为提高缓冲容量一般选用较高浓度缓冲液，本文选360mmol/L。

3.4样品分析中的阳离子耗尽富集法

在烟草样品分析中，要检测比烟碱含量低得多的米渥斯明，必须加大进样量。

而进样量增大又会降低分离度，特别是紧靠烟碱的去甲基烟碱。

在进样前加一小段适当长的水塞，具有堆积作用，即阳离子耗尽富集法，会使分离样品富集，谱峰更尖锐，分离度改善。

固定进水塞时间分别为0,10,20和30s，考察进样时间20,40和60s对米渥斯明峰高和去甲基烟碱与烟碱之间的分离度的影响。

图5表明米渥斯明的峰高总是随进样时间的延长而增大，但随进水时间的变化却有一个最佳时间10s。

图5米渥斯明的峰高随进水时间和进样时间的变化

Fig5Effectofinjectiontimesofwaterplugandsamplesolutiononpeakheightofmyosmine.

图6说明去甲基烟碱与烟碱间的分离度随进样时间的延长而降低,进样时间超过50s，分离度均小于1。

进水时间有一个最佳值10s。

综上所述，优化后的进水时间为10s，进样时间为50s。

图6去甲基烟碱与烟碱之间的分离度随进水时间和进样时间的变化

Fig.6Effectofinjectiontimeofwaterandstandardsolutiononresolutionbetweennornicotineandnicotine.

3.5　分离与定性

电泳电压也会影响实际烟草样品的生物碱分离。

由于烟碱浓度高，去甲烟碱不易与烟碱分离。

电泳电压12kV时，可使去甲烟碱与烟碱基线分离。

在上述优化条件下，实际样品的分离图谱见图7。

将标准峰的相对保留时间（即其它烟碱保留时间对烟碱保留时间的比值）与实际样品峰的相对保留时间比较,分离物即可得到确认。

图7实际样品的分离谱图

Fig.7electrophorogramoftobaccosample

References

1XinHuijun（辛惠君）,XieFuwei（谢复炜）,DengDajun（邓大君）.ChineseJournalofAnalyticalChemistry（分析化学）,2000,48（4）:

436-438

2HechtSS.MutationResearch,1999,424:

127-142

3KleinsasserNH,WallnerBC,HarreusUA,ZwickenpflugW,RichterE.Toxicology,2003,192:

171-177

4YangSSandSmetenaI.Chromatographia.,1995,40:

375-378

5YangSS,SmetenaI,GoldsmithAI.JournalofChromatographyA,1996,746:

131-136

AbstractTherehasbeenverylittlepublishedwithrespecttotheseparationofmyosmineandotheralkaloidsintobaccowithcapillaryelectrophoresisusingaphosphatebuffer.Inthiswork,wehavedevelopedanewelectrolytesystemfortheseparationofthetobaccoalkaloidswithcapillaryelectrophoresis.whichiscapableofresolvingmyosmineandotheralkaloidsintobacco.WefoundahighlyconcentratedtartaricbufferatlowpHprovidedhigherseparationefficiencyandhighersensitivitycomparedtophosphatebuffer.Applicationofcationexhaustconcentrationtodetectionofminoralkaloidsintobaccowasdiscussed.

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