国家自然科学基金标书文档格式.docx

1、E重大 F. 重点 H. 专项高技术探索项目主题号申报学科名称1名称2A. 基础研究代码1代码2B. 应用研究申请金额起止年月所在实验室A. 国家重点 B.部门开放 实验室编号申请者姓中文性别A. 男B. 女出生年月民族名称汉拼音身份证号代码01专业技术职务学位A. 博士B. 硕士C. 学士博士学位授予国别 或地区国（地区）名A.院士B.博士生导师C博士博士后 代 码B所在单 系（所） 单位代码性 质A. 高等院校B. 科研机构邮政编码隶属关系 名 称申请者电话C. 其它所在地 湖南省 项目组 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 参加单位数94 41主要成员不含 姓 名 身份证号

2、专业技术 职务所在单位名称 及代码 项目中 的分工指 导质粒构建及转染端粒酶活性检测MAPK磷酸化检测细胞培养动物实验癌基因活性检测STAT3磷酸化检测-1-内容和意义 摘 要本课题利用分子生物学、细胞培养和免疫学技术从细胞信号转导通路的角度研究HCV NS3和HCV NS5蛋白对细胞的转化作用。主要探讨HCV两种非结构蛋白对MAPK和JAK/STAT3信号通路影响；HCV NS3和NS5主要是影响级联的哪个环节； HCV NS3和HCV NS5两种蛋白究竟哪种对信号转导通路的影响效用强。本课题将为HCV致癌机制的研究提供新模型和实验证据，同时亦为临床防治HCC提供新思路和理论依据。主题词 1

3、. 主题词数量不多于三个； 2. 主题词之间空一格（英文用/分隔）中 文丙型肝炎病毒 信号转导 转化 英文Hepatitis virus C/signal transduction/transformation简表填写要求一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所用代码以最新发 布的国家自然科学基金申请项目分类目录及代码为准填写。高技术探索课题主题号按高技术新概 念新构思探索课题项目指南中主题号填写，申请其重点项目时项目类别也填写B，并在申请书封面右 上角加注“高技术探索课题重点项目”。 二、凡选择性栏目，将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。 三、部

4、分栏目填写要求： 项目名称 应确切反映研究内容和范围，最多不超过25个汉字（包括标点符号）。 基础研究 指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。 应用基础研究 指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。 申报学科 申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个，先填为主学科。 申请金额 以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。 起止年月 起始时间从申请的次年1月算起。终止时间为完成年度的12月。 所用实验室 系指研究项目将利用的实验室，仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的 开放实验室。 所在单位名称及代码 按单位公章填写全称。

5、例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填 “中科院西安光机所”或“西安光机所”。全称中的数字，一律写中文,例如： 中国航天工业总公司第七0一所。首次申请国家自然科学基金的单位，尚未 编入单位代码，其代码暂不填写。 参加单位数 指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位（合作者所在单位）,以 阿拉伯数字表示。 项目组主要成员 指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及项目的完成起重要作 用的人员，本人应在申请书上亲自签名。本栏双线右侧内容不输入计算机。 研究内容和意义 摘要和主题词均录入软盘。-2-二、立论依据（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及

6、出处）对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用前景。丙型肝炎病毒（HCV）与肝细胞癌（HCC）发生的关系十分密切，但其确切的致癌机制尚不清楚。我国是HCV高感染区和HCC高发区，故探讨HCV的致癌机理对HCC的预防和治疗具有十分重要意义。分子生物学的应用使人们对HCV的结构和其在HCC发生中的作用已有初步认识。HCV是一种正链RNA病毒，无逆转录酶活性，不能象HBV以“病毒基因组插入”方式激活癌基因。特别是HCV致癌动物模型难以复制，限制了HCV致癌机制的研究。目前，普遍推测HCV可能是通过其

7、表达的蛋白质起作用。其中非结构蛋白NS3和NS5在HCC发生中的作用尤其重要，Sakamuro等发现HCV NS3蛋白可使NIH/3T3细胞转化，接种裸鼠可形成肿瘤；我们的研究观察到HCV NS3蛋白主要通过内源性机制间接作用于p53基因使其突变导致肝细胞癌变；用构建的HCV NS3蛋白表达质粒（pRcHCNS3-5）转染NIH/3T3细胞，使细胞端粒酶活性显著增高，但HCV NS3和HCV NS5蛋白是通过何种方式使细胞恶性转化，尚缺乏直接证据。既往研究表明信号转导控制着细胞的生长、分化；信号转导级联异常与细胞的恶性转化关系密切。Ras/Raf/丝裂原激活的蛋白激酶K（Ras/Raf/MAP

8、K）级联反应是一种主要的生长因子和细胞因子信号转导通路，包括ras-GTP的形成、细胞膜Raf激酶活化并激活MAPK激酶（MAPKK）、继而通过苏氨酸和酪氨酸残基双磷酸化激活MAPK，活化的MAPK移入核内使三聚体因子（ternary complex factor）TCF磷酸化，后者再激活立早癌基因如c-fos和egr-1。Janus酪氨酸蛋白激酶（JAKs）/信号转导和转录激活因子（Stat3）级联是新近发现的另一重要的信号转导通路。JAKs系非受体型酪氨酸激酶，使Stat3酪氨酸705（Tyr-705）磷酸化而激活Stat3，活化的Stat3进入核内与DNA应答元件（response el

9、ements）结合，引起基因表达。在肿瘤的发生发展中Ras/Raf/MAPK和JAKs/ Stat3信号级联的相互关系文献报道的结果不一。由于MAPK和Stat3均可被多种生长因子和细胞因子激活，多数学者认为MAPK可促进Stat3活化。Chung等观察到MAPK可以使Stat3丝氨酸727位点磷酸化而激活Stat3；Leaman等亦发现某些生长因子（EGF和PDGF）对Stat3的激活并不一定通过JAKs，但Jain等的结果提示活化的MAPK抑制Stat3转录活性。HCV蛋白对细胞信号转导通路的影响慢性肝炎的发生关系在国外已有少数报道：You等观察到HCV核心蛋白能增强由淋巴毒素受体配体和肿

10、瘤坏死因子触发NF-B信号转导通路的效用，使HCV感染呈慢性活动和慢性持续状态；Tsuchihara等亦发现HCV核心蛋白具有调节信号转导通路和细胞生长的作用；但Heim等的研究表明HCV蛋白可通过JAK-STAT信号通路抑制信号转导，并认为这可能是HCV对干扰素治疗无效和病毒持续感染的主要原因；Borowski等发现HCV NS3蛋白可与cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）游离催化亚单位结合，阻止催化亚单位进入核内，影响PKA的功能；Tan等观察到HCV NS5A能特异性地与生长因子受体联接蛋白2（Grb2）的接合器蛋白（adaptor protein）结合，并作为细胞信号转导通路中的一种病毒

11、拦截器干扰Grb2介导的信号通路。HCV感染对细胞信号级联的影响在HCC发生中的作用国内外尚未见文献报道。本课题组及其他学者的研究结果显示HCVN S3和HCV NS5蛋白均定位于细胞浆，它们不可能与核内蛋白和DNA直接结合引起基因表达，故推测它们可能是通过影响细胞信号级联使细胞发生恶性转化。鉴于既往研究结果，本课题利用分子生物学和细胞培养技术从细胞信号转导通路的角-3-1-度研究HCV NS3和HCV NS5蛋白对细胞信号转导通路的影响及细胞的转化作用。主要探讨： HCV两种非结构蛋白对MAPK和JAK/STAT3信号通路影响； HCV NS3和HCV NS5主要是影响级联的哪个环节；本课题

12、的研究可望对HCV致癌机制有一个比较合理的阐述，并为临床防治HCV所致HCC提供理论依据。本课题是两个卫生部课题（94-120和 98-1-110）研究的延续，为本课题的研究打下了一定的基础，并做了如下工作： 观察到HCV NS3蛋白在HCC发生中起重要作用； 利用逆转录PCR对HCC组织中HCV的基因型进行了研究； 利用原位杂交检测了HCV RNA在HCC和癌旁肝组织中的定位和分布； 利用原位逆转录方法检测了HCC和癌旁肝组织中端粒酶的活性，并在方法学上进行了改进；利用分子生物学和细胞培养技术研究了HCV NS3基因转染NIH/3T3细胞后细胞端粒酶活性的变化；HCV E1，E2/NS1，N

13、S5蛋白基因在大肠杆菌内表达的实验研究；1999年本课题组与美国New England Biolab合作研究了MAPK信号转导通路的异常与乳腺癌和肝细胞癌发生的关系。参考文献1.Sakamuro D, et al. Hepatitis C virus nonstructural protein NS3 transformsNIH/3T3 cells. J Virol,1995,69（6）:38932.冯德云，等. 肝癌发生中丙型肝炎病毒NS3蛋白对p53 基因蛋白表达的影响。中华医学杂志，1998，78（4）：2783.冯德云，等. 肝细胞癌与癌旁肝组织中HCV RNA原位分子杂交和HBsAg

14、 免疫组化研究。中华病理学杂志，1998，27（3）：2204.冯德云，等. 湖南地区丙型肝炎病毒基因型在肝细胞癌组织中的分布。湖南医科大学学报，1998，23（3）：2325.刘双虎，等, 丙型肝炎病毒E1，E2/NS1，NS5蛋白基因在大肠杆菌内的表达及其产物的初步应用。中华传染病学杂志，1998，16（1）：6.刘双虎，等. 丙型肝炎病毒NS5基因片段的克隆与表达。湖南医科大学学报，1996，21（3）：2427.Jain N, et al. Repression of Stat3 activity activation of mitogen-activated protein kina

15、se （MAPK）. Oncogen, 1998, 17（24）: 3157Leaman DW, et al. Roles of JAKs in activation of STATs and stimulation of c-fos gene expression by epidermal growth factor. Mol Cell Biol, 1996, 16（1）: 3698.Chung J,. STAT3 serine phosphorylation by ERK-dependent and -independent pathways negatively modulates it

16、s tyrosine phosphorylation. Mol Cell Biol, 1997, 17（11）: 65089.Ihle JN,et al STATs: signal transducers and activators of transcription. Cell, 1996, 84（3）: 33110.You LR, et al Hepatitis C virus core protein enhances NF-B signal pathway triggering by lymphotoxin- receptor ligand and tumor necrosis fac

17、tor alpha. J Virol, 1999, 73（2）:1672-8111.Tsuchihara K, et al. Hepatitis C virus core protein regulates cell growth and signal transduction pathway transmitting growth stimuli. Virology, 1999, 258: 10012.Heim MH, et al. Expression of hepatitis C virus proteins inhibits signal transduction through th

18、e Jak-STAT pathway. J Virol, 1999, 73（2）: 846913.Borowski P, et al. Nonstructural protein 3 of hepatitis C virus blocks the distribution of the free catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinase. J Virol, 1997, 71（4）: 283814.Tan SL, et al. NS5, a nonstructural protein of hepatitis C virus

19、, binds growth factor receptor-bound protein 2 adaptor protein in a src homology 3 domain/ligand-dependent manner and perturbs mitogenic signaling. Proc Natl Acad Sic USA, 1999, 96:5533-3-2-三、研究方案1研究目标、研究内容和拟解决的关键问题本课题的研究是以以下假说为依据：HCV感染机体后，病毒通过其表达的蛋白质，特别是HCVNS3和HCVNS5蛋白引起细胞信号转导通路MAPK和JAK/STAT3级联的异常，

20、激活癌基因和端粒酶，导致细胞恶性转化。研究内容构建HCV NS3和HCV NS5表达质粒并用它们分别和联合转染NIH/3T3细胞。观察细胞的转化和成瘤性；检测MAPK和JAK/STAT3信号转导通路各级联成分的改变；检测立早癌基因c-foc、c-jun和egr-1等的表达；检测癌基因ras、myc和src的激活情况；利用TRAP-PCR检测端粒酶活性的改变。研究目标通过上述研究从下列几个方面探讨HCV的致癌机制，并为临床防治HCC提供理论依据。1HCVNS3和HCVNS5表达质粒转染NIH/3T3细胞后是否导致MAPK和JAK/STAT3信号转导通路的异常改变；2HCV NS3和NS5主要是影

21、响级联的哪个环节；3HCVNS3和HCVNS5表达质粒转染NIH/3T3细胞是否导致立早癌基因和癌基因的异常激活。4HCVNS3和HCVNS5表达质粒转染NIH/3T3细胞是否导致端粒酶活性的升高。5转化的NIH/3T3细胞接种裸鼠后生成肿瘤的机率有多大，其组织学形态有何改变；拟解决的关键问题在理论上拟解决的关键问题是：1HCV可能是通过其表达的蛋白质，特别是HCVNS3和HCVNS5导致细胞信号转导通路的异常、癌基因的异常激活和端粒酶活性增高，最终使发生细胞恶性转化；2HCVNS3和HCVNS5导致细胞信号转导通路的异常是细胞恶性转化的前提和条件。3利用NS3和NS5表达质粒转染NIH/3T

22、3细胞从细胞信号转导角度探讨HCV致癌机制，可望在一定程度上解决由于HCV致癌动物模型难以复制，限制HCV致癌机制研究的问题。在技术上拟解决的关键问题是：1 保证各实验组间的平行性和资料的可比性；2 避免NIH/3T3细胞的自身转化；-4-2拟采用的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析按Sakamuro等和我们的方法分别构建HCVNS3和HCVNS5表达质粒pRcHCNS3-5（nt 3354-4210）和PMAL-CRI-NS5（nt 6625-7027），转染NIH/3T3细胞，观察细胞的转化情况，分离细胞胞浆和胞核并利用Western blot方法检测转染和不转染的NIH/3T3胞浆

23、和胞核中MAPK、STAT3的磷酸化状况；利用Northern blot方法检测转染和不转染的NIH/3T3细胞立早癌基因c-jun、c-fos、egr-1和癌基因基因ras、myc和src的激活情况；利用TRAP-PCR检测端粒酶活性的改变；用转染的NIH/3T3细胞接种裸鼠观察肿瘤生成情况，并用HepG2细胞株作阳性对照，采用不转染的NIH/3T3细胞作平行实验，以保证方法学上的可比性和排除NIH/3T3细胞自身转化的可能。在实验中，我们还将利用HCV NS3和HCV NS5反义DNA经脂质体转染入上述已转化的NIH/3T3细胞，然后再检测上述已列出的指标。技术路线研究方法和可行性分析1本

24、课题采用的分子生物学、细胞培养、免疫学及检测端粒酶活性的TRAP-PCR等技术已熟练掌握，并利用上述技术做了大量工作（见研究基础）。2 本课题组已完成了HCVNS3 和HCVNS5表达质粒（pRcHCNS3-5，PMAL-CRI-NS5）的构建，为本课题的完成创造了首要条件。3 近年，美国New England Biolab已研制了检测MAKK和Stat3磷酸化的抗体phospho-5-1-p44/42MAP kinase（Erk1/Erk2）（Thr202/Tyr204）、phospho-p38MAP kinase（Thr108/Tyr182）、phospho-stat3（Tyr705）和

25、phospho-stat3（Ser727），故利用Western blot或免疫组化即可检测MAPK和Stat3的磷酸化。特别是本课题组与其合作，进行了MAPK和STAT3磷酸化在乳腺癌和肝细胞癌发生过程中的作用，并获得满意的结果。4硫代磷酸脂修饰的HCV NS3和HCV NS5反义寡核苷酸参照文献（Takamizawa A, et al. J Virology, 1991, 65: 1105）序列，由美国辛辛拉提大学DNA中心为我们有偿合成制备。5大部分试剂国内公司有购；检测MAKP（Erk1/Erk2，p38）和STAT3磷酸化的试剂盒可由美国New England Biolab有偿提供；

26、脂质体lipofectin可从Sigma公司购得；细胞株NIH/3T3（购自美国ATCC公司）和HepG2本室有现货。6上两个卫生部课题的研究为本项目的完成打下了一定的基础。7我们认为实验方案中的单项操作是不困难的，但本项目分组和检测指标较多，如何保证实验资料的可比性和研究结果的科学性，是必须认真对待的问题。此外，在实验过程中应排除NIH/3T3细胞自身转化对结果的影响，为此，本课题组采用的NIH/3T3细胞是来自美国ATCC公司，该细胞自身转化率低，并在实验操作中作了如下安排和处理。（1）细胞转染实验：采用同一批解冻的NIH/3T3细胞在相同的条件下用HCV NS3表达质粒pRcHCNS3-

27、5和PMAL-CRI-NS5单独联合转染NIH/3T3细胞，在选择性琼脂培基上培养，并挑选阳性克隆，再经Southern blot技术进一步鉴定阳性克隆确实是有HCV NS3表达质粒转染的NIH/3T3细胞；然后接种与液体培养基中培养。每组接种8瓶（共24瓶）。以空白质粒转染作阴性对照；用8瓶NIH/3T3细胞作平行实验。（2）转染细胞的成瘤性检测：上述转染阳性的NIH/3T3细胞、作平行实验实验的NIH/3T3细胞和HepG2细胞株，经过相同的传代次数后接种裸鼠，观察成瘤性。（3）HCV NS3、HCV NS5蛋白的表达和MAPK和Stat3磷酸化检测：分别从24瓶转染阳性的NIH/3T3细

28、胞和8瓶作平行实验实验的NIH/3T3细胞内抽提蛋白质，点样在同一尼龙膜上（18张），电泳后分别用抗HCV NS3和HCV NS5抗体及检测MAPK和Stat3磷酸化的抗体phospho-p44/42MAP kinase（Erk1/Erk2）（Thr202/Tyr204）, phospho-p38MAP kinase（Thr108/Tyr182）、phospho-stat3（Tyr705）和 phospho-stat3（Ser727）进行western blot，分别检测HCV NS3、HCV NS5蛋白的表达及MAPK（Erk1/Erk2、p38）和Stat3的磷酸化，重复3次（每次用点样尼

29、龙膜6张，共18张），然后利用计算机图象处理系统分析其光密度。（4）立早癌基因c-jun、c-fos、egr-1和癌基因基因ras、myc和src的RNA检测：分别从24瓶转染阳性的NIH/3T3细胞和8瓶作平行实验实验的NIH/3T3细胞内抽提RNA，点样在同一尼龙膜上，先后与c-jun、c-fos、egr-1、ras、myc和src rRNA探针杂交（Northern blot），重复3次。（5）检测端粒酶活性的变化：取（4）抽提的部分RNA，用TRAP-PCR检测转染阳性的NIH/3T3细胞和作平行实验实验的NIH/3T3细胞端粒酶活性的变化，重复3次。（6）反义寡核苷酸转染及其指标的检测：取上述pRcHCNS3-5和PMAL-CRI-NS5转染的阳性