国家自然科学基金标书文档格式.docx
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E．重大F.重点H.专项
高技术探索
项目主题号
申报
学科
名称1
名称2
A.基础研究
代码1
代码2
B.应用研究
申请金额
起止年月
所在实验室
A.国家重点B.部门开放
实验室编号
申
请
者
姓
中文
性
别
A.男
B.女
出生年月
民
族
名称
汉
拼音
身份证号
代码
01
专业
技术
职务
学
位
A.博士
B.硕士
C.学士
博士学位
授予国别
或地区
国（地区）名
A.院士
B.博士生导师
C博士博士后
代码
B
所
在
单
系（所）
单位代码
性质
A.高等院校
B.科研机构
邮政编码
隶属
关系
名称
申请者电话
C.其它
所在地
湖南省
项目组
总人数
高级
中级
初级
博士后
博士生
硕士生
参加单位数
9
4
4
1
主
要
成
员
不
含
姓名
身份证号
专业技术
职务
所在单位名称
及代码
项目中
的分工
指导
质粒构建及转染
端粒酶活性检测
MAPK磷酸化检测
细胞培养
动物实验
癌基因活性检测
STAT3磷酸化检测
-1-
内
容
和
意
义
摘
要
本课题利用分子生物学、细胞培养和免疫学技术从细胞信号转导通路的角度研究HCVNS3和HCVNS5蛋白对细胞的转化作用。
主要探讨①HCV两种非结构蛋白对MAPK和JAK/STAT3信号通路影响；
②HCVNS3和NS5主要是影响级联的哪个环节；
③HCVNS3和HCVNS5两种蛋白究竟哪种对信号转导通路的影响效用强。
本课题将为HCV致癌机制的研究提供新模型和实验证据，同时亦为临床防治HCC提供新思路和理论依据。
主题词
1.主题词数量不多于三个；
2.主题词之间空一格（英文用/分隔）
中文
丙型肝炎病毒信号转导转化
英文
HepatitisvirusC/signaltransduction/transformation
简表填写要求
一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。
简表中所用代码以最新发
布的《国家自然科学基金申请项目分类目录及代码》为准填写。
高技术探索课题主题号按《高技术新概
念新构思探索课题项目指南》中主题号填写，申请其重点项目时项目类别也填写B，并在申请书封面右
上角加注“高技术探索课题重点项目”。
二、凡选择性栏目，将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。
三、部分栏目填写要求：
项目名称——应确切反映研究内容和范围，最多不超过25个汉字（包括标点符号）。
基础研究——指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。
应用基础研究——指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。
申报学科——申请项目所属的最基础学科。
如涉及多学科可填写两个，先填为主学科。
申请金额——以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。
起止年月——起始时间从申请的次年1月算起。
终止时间为完成年度的12月。
所用实验室——系指研究项目将利用的实验室，仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的
开放实验室。
所在单位名称及代码——按单位公章填写全称。
例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填
“中科院西安光机所”或“西安光机所”。
全称中的数字，一律写中文,例如：
中国航天工业总公司第七0一所。
首次申请国家自然科学基金的单位，尚未
编入单位代码，其代码暂不填写。
参加单位数——指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位（合作者所在单位）,以
阿拉伯数字表示。
项目组主要成员——指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及项目的完成起重要作
用的人员，本人应在申请书上亲自签名。
本栏双线右侧内容不输入计算机。
研究内容和意义——摘要和主题词均录入软盘。
-2-
二、立论依据
（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处）
对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；
对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述
其应用前景。
丙型肝炎病毒（HCV）与肝细胞癌（HCC）发生的关系十分密切，但其确切的致癌机制尚不清楚。
我国是HCV高感染区和HCC高发区，故探讨HCV的致癌机理对HCC的预防和治疗具有十分重要意义。
分子生物学的应用使人们对HCV的结构和其在HCC发生中的作用已有初步认识。
HCV是一种正链RNA病毒，无逆转录酶活性，不能象HBV以“病毒基因组插入”方式激活癌基因。
特别是HCV致癌动物模型难以复制，限制了HCV致癌机制的研究。
目前，普遍推测HCV可能是通过其表达的蛋白质起作用。
其中非结构蛋白NS3和NS5在HCC发生中的作用尤其重要，Sakamuro等发现HCVNS3蛋白可使NIH/3T3细胞转化，接种裸鼠可形成肿瘤；
我们的研究观察到HCVNS3蛋白主要通过内源性机制间接作用于p53基因使其突变导致肝细胞癌变；
用构建的HCVNS3蛋白表达质粒（pRcHCNS3-5’）转染NIH/3T3细胞，使细胞端粒酶活性显著增高，但HCVNS3和HCVNS5蛋白是通过何种方式使细胞恶性转化，尚缺乏直接证据。
既往研究表明信号转导控制着细胞的生长、分化；
信号转导级联异常与细胞的恶性转化关系密切。
Ras/Raf/丝裂原激活的蛋白激酶K（Ras/Raf/MAPK）级联反应是一种主要的生长因子和细胞因子信号转导通路，包括ras-GTP的形成、细胞膜Raf激酶活化并激活MAPK激酶（MAPKK）、继而通过苏氨酸和酪氨酸残基双磷酸化激活MAPK，活化的MAPK移入核内使三聚体因子（ternarycomplexfactor）TCF磷酸化，后者再激活立早癌基因如c-fos和egr-1。
Janus酪氨酸蛋白激酶（JAKs）/信号转导和转录激活因子（Stat3）级联是新近发现的另一重要的信号转导通路。
JAKs系非受体型酪氨酸激酶，使Stat3酪氨酸705（Tyr-705）磷酸化而激活Stat3，活化的Stat3进入核内与DNA应答元件（responseelements）结合，引起基因表达。
在肿瘤的发生发展中Ras/Raf/MAPK和JAKs/Stat3信号级联的相互关系文献报道的结果不一。
由于MAPK和Stat3均可被多种生长因子和细胞因子激活，多数学者认为MAPK可促进Stat3活化。
Chung等观察到MAPK可以使Stat3丝氨酸727位点磷酸化而激活Stat3；
Leaman等亦发现某些生长因子（EGF和PDGF）对Stat3的激活并不一定通过JAKs，但Jain等的结果提示活化的MAPK抑制Stat3转录活性。
HCV蛋白对细胞信号转导通路的影响慢性肝炎的发生关系在国外已有少数报道：
You等观察到HCV核心蛋白能增强由淋巴毒素β受体配体和肿瘤坏死因子α触发NF-κB信号转导通路的效用，使HCV感染呈慢性活动和慢性持续状态；
Tsuchihara等亦发现HCV核心蛋白具有调节信号转导通路和细胞生长的作用；
但Heim等的研究表明HCV蛋白可通过JAK-STAT信号通路抑制信号转导，并认为这可能是HCV对α干扰素治疗无效和病毒持续感染的主要原因；
Borowski等发现HCVNS3蛋白可与cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）游离催化亚单位结合，阻止催化亚单位进入核内，影响PKA的功能；
Tan等观察到HCVNS5A能特异性地与生长因子受体联接蛋白2（Grb2）的接合器蛋白（adaptorprotein）结合，并作为细胞信号转导通路中的一种病毒拦截器干扰Grb2介导的信号通路。
HCV感染对细胞信号级联的影响在HCC发生中的作用国内外尚未见文献报道。
本课题组及其他学者的研究结果显示HCVNS3和HCVNS5蛋白均定位于细胞浆，它们不可能与核内蛋白和DNA直接结合引起基因表达，故推测它们可能是通过影响细胞信号级联使细胞发生恶性转化。
鉴于既往研究结果，本课题利用分子生物学和细胞培养技术从细胞信号转导通路的角
-3-1-
度研究HCVNS3和HCVNS5蛋白对细胞信号转导通路的影响及细胞的转化作用。
主要探讨：
①HCV两种非结构蛋白对MAPK和JAK/STAT3信号通路影响；
②HCVNS3和HCVNS5主要是影响级联的哪个环节；
本课题的研究可望对HCV致癌机制有一个比较合理的阐述，并为临床防治HCV所致HCC提供理论依据。
本课题是两个卫生部课题（94-120和98-1-110）研究的延续，为本课题的研究打下了一定的基础，并做了如下工作：
①观察到HCVNS3蛋白在HCC发生中起重要作用；
②利用逆转录PCR对HCC组织中HCV的基因型进行了研究；
③利用原位杂交检测了HCVRNA在HCC和癌旁肝组织中的定位和分布；
④利用原位逆转录方法检测了HCC和癌旁肝组织中端粒酶的活性，并在方法学上进行了改进；
⑤利用分子生物学和细胞培养技术研究了HCVNS3基因转染NIH/3T3细胞后细胞端粒酶活性的变化；
⑥HCVE1，E2/NS1，NS5蛋白基因在大肠杆菌内表达的实验研究；
⑦1999年本课题组与美国NewEnglandBiolab合作研究了MAPK信号转导通路的异常与乳腺癌和肝细胞癌发生的关系。
参考文献
1.SakamuroD,etal.HepatitisCvirusnonstructuralproteinNS3transformsNIH/3T3cells.JVirol,1995,69（6）:
3893
2.冯德云，等.肝癌发生中丙型肝炎病毒NS3蛋白对p53基因蛋白表达的影响。
中华医学杂志，1998，78（4）：
278
3.冯德云，等.肝细胞癌与癌旁肝组织中HCVRNA原位分子杂交和HBsAg免疫组化研究。
中华病理学杂志，1998，27（3）：
220
4.冯德云，等.湖南地区丙型肝炎病毒基因型在肝细胞癌组织中的分布。
湖南医科大学学报，1998，23（3）：
232
5.刘双虎，等,丙型肝炎病毒E1，E2/NS1，NS5蛋白基因在大肠杆菌内的表达及其产物的初步应用。
中华传染病学杂志，1998，16
（1）：
6.刘双虎，等.丙型肝炎病毒NS5基因片段的克隆与表达。
湖南医科大学学报，1996，21（3）：
242
7.JainN,etal.RepressionofStat3activityactivationofmitogen-activatedproteinkinase（MAPK）.Oncogen,1998,17（24）:
3157LeamanDW,etal.RolesofJAKsinactivationofSTATsandstimulationofc-fosgeneexpressionbyepidermalgrowthfactor.MolCellBiol,1996,16
（1）:
369
8.ChungJ,.STAT3serinephosphorylationbyERK-dependentand-independentpathwaysnegativelymodulatesitstyrosinephosphorylation.MolCellBiol,1997,17（11）:
6508
9.IhleJN,etalSTATs:
signaltransducersandactivatorsoftranscription.Cell,1996,84（3）:
331
10.YouLR,etalHepatitisCviruscoreproteinenhancesNF-κBsignalpathwaytriggeringbylymphotoxin-βreceptorligandandtumornecrosisfactoralpha.JVirol,1999,73
（2）:
1672-81
11.TsuchiharaK,etal.HepatitisCviruscoreproteinregulatescellgrowthandsignaltransductionpathwaytransmittinggrowthstimuli.Virology,1999,258:
100
12.HeimMH,etal.ExpressionofhepatitisCvirusproteinsinhibitssignaltransductionthroughtheJak-STATpathway.JVirol,1999,73
（2）:
8469
13.BorowskiP,etal.Nonstructuralprotein3ofhepatitisCvirusblocksthedistributionofthefreecatalyticsubunitofcyclicAMP-dependentproteinkinase.JVirol,1997,71（4）:
2838
14.TanSL,etal.NS5,anonstructuralproteinofhepatitisCvirus,bindsgrowthfactorreceptor-boundprotein2adaptorproteininasrchomology3domain/ligand-dependentmannerandperturbsmitogenicsignaling.ProcNatlAcadSicUSA,1999,96:
5533
-3-2-
三、
研究方案
1．研究目标、研究内容和拟解决的关键问题
本课题的研究是以以下假说为依据：
HCV感染机体后，病毒通过其表达的蛋白质，特别是HCVNS3和HCVNS5蛋白引起细胞信号转导通路MAPK和JAK/STAT3级联的异常，激活癌基因和端粒酶，导致细胞恶性转化。
研究内容
构建HCVNS3和HCVNS5表达质粒并用它们分别和联合转染NIH/3T3细胞。
①观察细胞的转化和成瘤性；
②检测MAPK和JAK/STAT3信号转导通路各级联成分的改变；
③检测立早癌基因c-foc、c-jun和egr-1等的表达；
④检测癌基因ras、myc和src的激活情况；
⑤利用TRAP-PCR检测端粒酶活性的改变。
研究目标
通过上述研究从下列几个方面探讨HCV的致癌机制，并为临床防治HCC提供理论依据。
1HCVNS3和HCVNS5表达质粒转染NIH/3T3细胞后是否导致MAPK和JAK/STAT3信号转导通路的异常改变；
2HCVNS3和NS5主要是影响级联的哪个环节；
3HCVNS3和HCVNS5表达质粒转染NIH/3T3细胞是否导致立早癌基因和癌基因的异常激活。
4HCVNS3和HCVNS5表达质粒转染NIH/3T3细胞是否导致端粒酶活性的升高。
5转化的NIH/3T3细胞接种裸鼠后生成肿瘤的机率有多大，其组织学形态有何改变；
拟解决的关键问题
在理论上拟解决的关键问题是：
1HCV可能是通过其表达的蛋白质，特别是HCVNS3和HCVNS5导致细胞信号转导通路的异常、癌基因的异常激活和端粒酶活性增高，最终使发生细胞恶性转化；
2HCVNS3和HCVNS5导致细胞信号转导通路的异常是细胞恶性转化的前提和条件。
3利用NS3和NS5表达质粒转染NIH/3T3细胞从细胞信号转导角度探讨HCV致癌机制，可望在一定程度上解决由于HCV致癌动物模型难以复制，限制HCV致癌机制研究的问题。
在技术上拟解决的关键问题是：
1保证各实验组间的平行性和资料的可比性；
2避免NIH/3T3细胞的自身转化；
-4-
2．拟采用的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
按Sakamuro等和我们的方法分别构建HCVNS3和HCVNS5表达质粒pRcHCNS3-5’（nt3354-4210）和PMAL-CRI-NS5（nt6625-7027），转染NIH/3T3细胞，观察细胞的转化情况，分离细胞胞浆和胞核并利用Westernblot方法检测转染和不转染的NIH/3T3胞浆和胞核中MAPK、STAT3的磷酸化状况；
利用Northernblot方法检测转染和不转染的NIH/3T3细胞立早癌基因c-jun、c-fos、egr-1和癌基因基因ras、myc和src的激活情况；
利用TRAP-PCR检测端粒酶活性的改变；
用转染的NIH/3T3细胞接种裸鼠观察肿瘤生成情况，并用HepG2细胞株作阳性对照，采用不转染的NIH/3T3细胞作平行实验，以保证方法学上的可比性和排除NIH/3T3细胞自身转化的可能。
在实验中，我们还将利用HCVNS3和HCVNS5反义DNA经脂质体转染入上述已转化的NIH/3T3细胞，然后再检测上述已列出的指标。
技术路线
研究方法和可行性分析
1本课题采用的分子生物学、细胞培养、免疫学及检测端粒酶活性的TRAP-PCR等技术已熟练掌握，并利用上述技术做了大量工作（见研究基础）。
2本课题组已完成了HCVNS3和HCVNS5表达质粒（pRcHCNS3-5’，PMAL-CRI-NS5）的构建，为本课题的完成创造了首要条件。
3近年，美国NewEnglandBiolab已研制了检测MAKK和Stat3磷酸化的抗体phospho-
-5-1-
p44/42MAPkinase（Erk1/Erk2）（Thr202/Tyr204）、phospho-p38MAPkinase（Thr108/Tyr182）、phospho-stat3（Tyr705）和phospho-stat3（Ser727），故利用Westernblot或免疫组化即可检测MAPK和Stat3的磷酸化。
特别是本课题组与其合作，进行了MAPK和STAT3磷酸化在乳腺癌和肝细胞癌发生过程中的作用，并获得满意的结果。
4硫代磷酸脂修饰的HCVNS3和HCVNS5反义寡核苷酸参照文献（TakamizawaA,etal.JVirology,1991,65:
1105）序列，由美国辛辛拉提大学DNA中心为我们有偿合成制备。
5大部分试剂国内公司有购；
检测MAKP（Erk1/Erk2，p38）和STAT3磷酸化的试剂盒可由美国NewEnglandBiolab有偿提供；
脂质体lipofectin可从Sigma公司购得；
细胞株NIH/3T3（购自美国ATCC公司）和HepG2本室有现货。
6上两个卫生部课题的研究为本项目的完成打下了一定的基础。
7我们认为实验方案中的单项操作是不困难的，但本项目分组和检测指标较多，如何保证实验资料的可比性和研究结果的科学性，是必须认真对待的问题。
此外，在实验过程中应排除NIH/3T3细胞自身转化对结果的影响，为此，本课题组采用的NIH/3T3细胞是来自美国ATCC公司，该细胞自身转化率低，并在实验操作中作了如下安排和处理。
（1）细胞转染实验：
采用同一批解冻的NIH/3T3细胞在相同的条件下用HCVNS3表达质粒pRcHCNS3-5’和PMAL-CRI-NS5单独联合转染NIH/3T3细胞，在选择性琼脂培基上培养，并挑选阳性克隆，再经Southernblot技术进一步鉴定阳性克隆确实是有HCVNS3表达质粒转染的NIH/3T3细胞；
然后接种与液体培养基中培养。
每组接种8瓶（共24瓶）。
以空白质粒转染作阴性对照；
用8瓶NIH/3T3细胞作平行实验。
（2）转染细胞的成瘤性检测：
上述转染阳性的NIH/3T3细胞、作平行实验实验的NIH/3T3细胞和HepG2细胞株，经过相同的传代次数后接种裸鼠，观察成瘤性。
（3）HCVNS3、HCVNS5蛋白的表达和MAPK和Stat3磷酸化检测：
：
分别从24瓶转染阳性的NIH/3T3细胞和8瓶作平行实验实验的NIH/3T3细胞内抽提蛋白质，点样在同一尼龙膜上（18张），电泳后分别用抗HCVNS3和HCVNS5抗体及检测MAPK和Stat3磷酸化的抗体phospho-p44/42MAPkinase（Erk1/Erk2）（Thr202/Tyr204）,phospho-p38MAPkinase（Thr108/Tyr182）、phospho-stat3（Tyr705）和phospho-stat3（Ser727）进行westernblot，分别检测HCVNS3、HCVNS5蛋白的表达及MAPK（Erk1/Erk2、p38）和Stat3的磷酸化，重复3次（每次用点样尼龙膜6张，共18张），然后利用计算机图象处理系统分析其光密度。
（4）立早癌基因c-jun、c-fos、egr-1和癌基因基因ras、myc和src的RNA检测：
分别从24瓶转染阳性的NIH/3T3细胞和8瓶作平行实验实验的NIH/3T3细胞内抽提RNA，点样在同一尼龙膜上，先后与c-jun、c-fos、egr-1、ras、myc和srcrRNA探针杂交（Northernblot），重复3次。
（5）检测端粒酶活性的变化：
取（4）抽提的部分RNA，用TRAP-PCR检测转染阳性的NIH/3T3细胞和作平行实验实验的NIH/3T3细胞端粒酶活性的变化，重复3次。
（6）反义寡核苷酸转染及其指标的检测：
取上述pRcHCNS3-5’和PMAL-CRI-NS5转染的阳性
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