流式细胞术原理与应用.docx

1、流式细胞术原理与应用流式细胞术详解一.流式细胞术概述 流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析,在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析;能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN

2、-COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICSALTRA和EPICSXL/XL-MCL,B-D公司最新产品为FACSVantage和FACSCalibur。EPICSXL/XL-MCL和FACSCalibur是临床型;EPICSALTRA和FACSVantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,多用于科学研究。二.流式细胞仪主要技术指标 1流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测10005000个细胞,大型

3、机可达每秒上万个细胞。2流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上600个荧光分子,两个细胞间的荧光差5%即可区分。3前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2m.5m。4流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到90%病例CD10+，而婴儿CD10+病例50%。FAB分类为L1、L2，白血病细胞的FS和SS都很低;一般TdT、HLA-DR、CD19阳性，大多数病例CD24、CD34阳性，本型细胞膜免疫球蛋白(Ig)阴性。此型有CD10+、CD10-两个亚型，CD10+型预后较CD10-型好。前B

4、细胞ALL：前B细胞ALL在发育阶段上较B祖细胞ALL晚，占儿童ALL的25%，在成人ALL占的比例还不清楚。一般CD24、HLA-DR、CD19、CD10、cCD22阳性，CD34阴性,鉴别特点时有胞浆重链。此型预后较B祖细胞ALL差，可能与t(1;19)有关，t(1;19)占前B细胞ALL的25%，此型CD34-，而B系列ALL中CD34-是独立的预后不良标记。B细胞ALL：B细胞ALL占所有ALL的2%-5%；B细胞ALL更为成熟，白血病细胞的FS和SS较B-祖细胞ALL明显增加，在FSSS直方图或SS(线性或对数)CD45直方图中处于淋巴细胞和单核细胞区域。典型标记是细胞膜免疫球蛋白（

5、sIg）阳性,表型一般为CD19、CD20、CD22、CD24阳性,多数病例CD10+，但sIg和成熟抗原出现可区别于更早的B系ALL。此型FAB分类一般为L3,罕见病例有B细胞ALL标记而FAB分类一般为L1，这些病人多有t(1;19)和t(14;18)。T细胞ALL：T细胞ALL占儿童ALL的15%,成人ALL的25%。多数表型为胸腺细胞型，最常见的是晚期胸腺皮质细胞亚型，CD1+、CD2+、CD5+、CD7+,CD4+CD8+，CD3表达较少，TdT常阳性；另一常见亚型是早期胸腺皮质细胞亚型，CD2+、CD5+、CD7+、TdT+。髓质期亚型较少见，CD2+、CD5+、CD7+，CD3+

6、CD4+或CD3+CD8+，TdT表达较少。前T细胞亚型，仅有CD7和cCD3而无其他T系抗原表达，预后较差。T系肿瘤性疾病多有特异性正常抗原表达的下调或表达该分化阶段正常不应出现的抗原。成人T细胞ALL预后较好，而儿童T细胞ALL较儿童B-祖细胞ALL和前B细胞ALL预后差，虽然各亚类预后仍不甚明确，但CD10阴性者预后不良。ALL的免疫学分型经过1986年前分为五型，1986-1994年分为两大类九型,九十年代后期(1997)分为四型的过程。1986年前的五型，是当时单克隆抗体和检测手段的反映；随着新的单克隆抗体（主要是T、B淋巴细胞亚群的McAb）的发现和临床大量病例的检测，不仅弄清了T

7、、B淋巴细胞的来源、分化发育过程，而且使免疫分型更加细致，因而出现了1986-1994年分为两大类九型；但按照细胞的分化发育阶段分型的两大类九型分型法对临床略显繁琐，指导治疗、判断预后临床实用性也不够强，因此又出现了以上简单的四型分类法。经过对比不难看出，四型分类法的B-祖细胞ALL型实际上包含了两大类九型分类法的非T-ALL的、3个亚型，而型即是前B细胞ALL型，型是B细胞ALL型；而T细胞ALL型是两大类九型中T-ALL的三型合并为一型。两大类九型分类法的非T-ALL的型分类为急性未分化白血病（见后）。ALL也可按DNA含量分类，用流式细胞仪很容易测定DNA含量，DNA含量分为两个亚类：超二倍体和亚二倍体，前者预后好，后者预后差。2.急性髓细胞白血病(AML)攪目前所有粒、单核系的单克隆抗体基本无分化