流式细胞术原理与应用.docx

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流式细胞术原理与应用

流式细胞术详解

一. 流式细胞术概述

    流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。

它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集（分选）某一亚群细胞,分选纯度＞95%。

在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:

BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司（简称B-D公司）。

流式细胞仪主要有两型:

临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。

BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。

EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,多用于科学研究。

二.流式细胞仪主要技术指标

1．流式细胞仪的分析速度：

一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。

2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：

一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。

3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：

前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。

4．流式细胞仪的分辨率：

通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。

   5．流式细胞仪的分选速度：

一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。

三.流式细胞仪主要构造和工作原理    流动室及液流驱动系统

流式细胞仪主要由以下五部分构成:

①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。

流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。

流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。

见图12.1流动室示意图。

流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种，供研究者选择。

小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。

图12.1流动室示意图（采自Coulter Training Guide）

四.流式细胞仪主要构造和工作原理    激光光源及光束形成系统

流式细胞仪可配备一根或多根激光管，常用的激光管是氩离子气体激光管，它的发射光波长488ηm,此外可配备氦氖离子气体激光管（波长633ηm）和/或紫外激光管。

流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的，荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关，激光是一种相干光源,它能提供单波长、高强度、高稳定性的光照，正是能达到这一要求的理想的激发光光源。

在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜，将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束（22μm×66μm），在这种椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致。

五.流式细胞仪主要构造和工作原理    光学系统

流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成，大致可分为流动室前和流动室后两组。

流动室前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小孔（一般为2片透镜、1个小孔）的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束，使激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致，最大限度的减少杂散光的干扰；流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成，滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管。

滤光片主要有三类：

长通滤片（LP）--只允许特定波长以上的光线通过，短通滤片（SP）-- 只允许特定波长以下的光线通过，带通滤片（BP）-- 只允许特定波长的光线通过，不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管（PMT）,如接收绿色荧光（FITC）的PMT前面配置的滤光片是LP550和BP525, 接收色橙红色荧光（PE）的PMT前面配置的滤光片是LP600和BP575, 接收红色荧光（CY5）的PMT前面配置的滤光片是LP650和BP675。

见图12.2光学系统和信号检测系统示意图。

六. 流式细胞仪主要构造和工作原理   信号检测系统

 当测定标本在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和荧光信号,散射光分为前向角散射（Forward Scatter, FS）和侧向角散射或900散射（Side Scatter, SS）,散射光是细胞的物理参数与细胞样本的制备（如染色）无关;荧光信号也有两种,一种是细胞自发荧光它一般很微弱,一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光，它是我们要测定的荧光,荧光信号较强,这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由,以便从测出的荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特异结合产生的荧光。

前向角散射（FS）反映被测细胞的大小,它由正对着流动室的光电二极管装置接收并转变为电信号；侧向角散射或900散射（SS）反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状, 它由一个光电倍增管（PMT） 接收并转变为电信号,这些电信号存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。

流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长（如氩离子气体激光管,它的发射光波488ηm,氦氖离子气体激光管发射光波长633ηm）。

488ηm激光光源常用的荧光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）、PE（藻红蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP（叶绿素蛋白）、ECD（藻红蛋白-得克萨斯红）等。

他们的激发光和发射光波长分别是：

             激发光波长（ηm）       发射光峰值（ηm）

FITC            488                      525（绿）

PE              488                      575（橙红）  

PI              488                      630（橙红）

ECD             488                      610（红）

CY5             488                      675（深红）

PreCP           488                      675（深红）

    各种荧光信号由各自的光电倍增管（PMT） 接收并转变为电信号后存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内.见图12.2光学系统和信号检测系统示意图。

七.流式细胞仪主要构造和工作原理   信号存储、显示、分析系统

（一） 信号存储

存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内的数据一般是以List mode（列表排队）方式存入的,采用List mode方式有两大优点:

①节约内存和磁盘空间②易于加工处理分析。

（二）信号显示和分析

由于List mode方式数据缺乏直观性，数据的显示和分析一般采用一维直

方图（图12.3）、二维点阵图（图12.4,12.5）、等高线图（图12.8）和密度图（图12.7）。

1．单参数数据显示和分析  细胞的每一个单参数测量数据用直方图来显 示，图中横坐标表示散射光或荧光信号相对强度值，其单位是道数，可以是线性的，也可以是对数的；纵坐标表示细胞数。

见图12.3一维直方图，图中横坐标是FITC荧光信号相对强度值（对数），纵坐标表示细胞数;图中已根据阴性对照设定适当的“门”（直线门），仪器的计算机就会给出测定值（包括阳性细胞%和平均荧光强度）。

2.双参数数据显示和分析  细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。

如图12.4二维点阵图，是正常人外周血白细胞的前向散射光（FS）和侧向散射光（SS）组成的点阵图，横坐标和纵坐标均是线性的，图中淋巴细胞、单核细胞、粒细胞很明显地分为3群，可以很容易地圈“门”（ Bitmap，无定型门），分析各亚群细胞的数据;图12.6假三维地形图（X轴:

 SSC ,Y轴:

FSC Z轴:

细胞数）更清楚地表明这一点。

图12.5二维点阵图是细胞的两种荧光（FITC和RD1）双参数数据显示，横坐标和纵坐标均是对数的，横坐标代表FITC，纵坐标代表PE，图中已设定适当的“门”（十字门），十字门的D1、D2、D3、D4门分别代表PE单阳性细胞、PE和FITC双阳性细胞 、阴性细胞、FITC单阳性细胞。

仪器的计算机就会给出两种荧光测定值（包括阴性细胞%、两种荧光各自的阳性细胞%、两种荧光的双阳性细胞%、各群细胞的平均荧光强度）。

 图12.7和图12.8分别是测定细胞的两种荧光双参数数据的密度图和等高线图，横坐标和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定十字门就可得到两种荧光的各种测定值，密度图和等高线图较点阵图更直观。

   3．三参数数据显示和分析  细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个数据组成一对（三参数测量数据和细胞数量每两个数据可组成6对数据）用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。

三个荧光数据关系用分光图（prism）表示，分光图可直接给出8个数据（如用ABC代表3种荧光，可有A+B+C+、A+B+C- 、A+B-C-、 A-B+C+、 A-B+C-、 A-B-C+、 A+B-C+ 、A-B-C-）。

见图12.9 prism，图12.9为人外周血淋巴细胞亚群测定结果的分光图，图中给出CD3、CD4、CD8组合的各种结果，如T辅助细胞（CD3+CD4+CD8-）为42.0%,如T抑制细胞（CD3+CD4+CD8-）为17.4%。

图12.5两种荧光的二维点阵图（采自Coulter Operaters Guide） 

   图12.7. 双参数数据的密度图（采自Coulter Operaters Guide）      

图12.6假三维地形图和二维点阵图（采自Coulter Operaters Guide）

   图12.8双参数数据的等高线图（采自Coulter Operaters Guide）

   图12.9 分光图（prism）

八.流式细胞仪主要构造和工作原理   细胞分选系统

 如在细胞流动室上装有超声压电晶体,通电后超声压电晶体发生高频震动，可带动细胞流动室高频震动,使细胞流动室喷咀流出的液流束断成一连串均匀的液滴, 每秒钟形成液滴上万个。

每个液滴中包含着一个样品细胞,液滴中的细胞在形成液滴前已被测量,如符合预定要求则可被充电,在通过偏转板的高压静电场时向左或向右偏转被收集在指定容器中,不含细胞液滴或细胞不符合预定要求液滴不被充电亦不发生偏转进入中间废液收集器中,从而实现了分选。

分选的详细原理和操作请有兴趣者参考有关文献。

九.  流式细胞术在血液学中的应用  DNA倍体分析及细胞周期分析

    在细胞周期内,DNA含量随细胞内时相发生周期性变化,正常情况下,大多数细胞处于休止期（Go）, G1期细胞虽有DNA合成，但DNA含量仍为2N，为二倍体细胞,;处于活跃的DNA合成期（S期）的细胞DNA含量为2N-4N;正经历细胞分裂（G2/M期）的细胞含有最大量的DNA（4N）。

细胞经固定后用PI（Propidium  Iodine 碘化丙啶）等荧光染料染色即可上机测定。

但标本需先经RNA酶处理以排除RNA干扰。

FCM可在测量大量细胞（数分钟可测定105个细胞）后给出DNA分布直方图,见图12.10.正常人外周血DNA示意图，图中第一个峰（G1）是DNA含量为2N 的细胞峰, 第二个峰是DNA含量为4N 的细胞峰,两峰之间是DNA含量为2N-4N的处于活跃的DNA合成期（S期）的细胞。

用厂家提供的Multicycle软件，计算机可自动计算出G1%、S+G2M%;如用DNA/RNA双参数分析,可得到G0:

G1%,G0/G1期DNA指数, 如标本中有凋亡细胞,在G1峰前会出现一个亚G1期峰,软件可自动计算出凋亡细胞的%。

图12.10.正常人外周血DNA示意图（采自Coulter Training Guide）

DNA倍体分析的临床有价值的指标是DNA非整倍体和/或超二倍体%和四倍体%增高。

这些改变是肿瘤细胞的特异性改变,和实体瘤相比,急性白血病非整倍体发生率较低,约30～40%。

十. 流式细胞术在血液学中的应用    淋巴细胞亚群测定

    淋巴细胞担负着免疫的主要功能。

淋巴细胞亚群的测定有助于了解机体免疫状况及一些疾病的监测。

临床经常测定的淋巴细胞亚群包括T淋巴细胞 （CD3+）, T 辅助细胞 （CD3+CD4+）, T 抑制细胞（CD3+CD8+）, B 淋巴细胞（CD19+或CD20+），NK 细胞 （CD3-CD56+）等。

常用来测定淋巴细胞亚群的单克隆抗体（Monoclonal  Antibody McAb）都是小鼠抗人Ig,有精制抗体,有直标荧光抗体,现在一些国外公司有双色和三色McAb出售,如CD4-FITC/CD8-RD1、CD3-CY5/CD4-FITC/CD8-PE等,此时应根据这些双色或三色McAb的Ig性质选择相应的阴性对照,如MsIgG1-RD1/MsIgG2-FITC等。

上机测定时应先测定阴性对照管,阴性对照的阳性细胞应＜2.0%。

三色测定可给出更为准确的各亚群的情况:

如真正的T 辅助细胞应是 CD3+CD4+CD8-, 真正的T 抑制细胞应是 CD3+CD4-CD8+,单标CD8+细胞中不仅有T 抑制细胞,还含有30%左右的NK细胞;而CD3+CD4-CD8-细胞群是γδT细胞,此类细胞与感染有关, CD3+CD4+CD8-细胞+CD3+CD4-CD8+细胞+CD3+CD4-CD8-细胞+CD3+CD4+CD8+细胞=CD3+细胞。

如单标记CD56不能准确测定NK 细胞,NK 细胞应是 （CD3-CD56+）,因为CD56+细胞中包含着非HLA束缚细胞毒T 细胞（CD3+CD56+）。

双色组合还能测定B 淋巴细胞（CD3-CD19+或CD20+）、激活的T 细胞（CD3+CD69+或CD3+25+）等。

应用适当的双色组合如CD4与CD29,CD4与CD45RA,可以测定T辅助细胞的的亚群。

如CD4+2H4（CD45RA）+细胞是Ts的诱导细胞;CD4+4B4（CD29）+细胞Th的诱导细胞。

同理,利用CD8+CD45RA和CD8+CD29+S6F1可测定T抑制细胞的亚群。

T辅助细胞还可分成Th1、Th2两个亚群，同时标记细胞内细胞因子IFN-γ和IL-4，可区分Th1细胞（CD4+/ IFN-γ+）和Th2细胞（CD4+/ IL-4+）。

利用CD25、CD69等McAb和其他淋巴细胞标记双色或三色标记还可测定淋巴细胞亚群的功能状态，如活化T8、活化B细胞等。

    以下给出常用细胞亚群的正常范围供参考,请注意同一CD中有多种克隆的McAb, 同一CD中不同McAb所测出的数值不同,每个实验室应测定自己实验室的正常数值。

    CD3+             70.0±12.0%      +4B4+                23.0±7.0%

    CD3+CD4+CD8-      40.0±9.0%         CD4+2H4+                19.0±6.0%

    CD3+CD4-CD8+      30.0±8.0%

CD3-CD56+（NK）     12.0±8.0%

十一.流式细胞术在血液学中的应用    白血病免疫分型原理

    白血病免疫学分型是利用单克隆抗体（McAb）检测白血病细胞的细胞膜和细胞浆抗原,分析其表现型,以了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。

对白血病细胞抗原的分析研究有助于对白血病分型,为诊断和治疗提供依据。

白血病免疫分型是形态学分型的重要补充和进一步深化，国际MIC分型协作组认为每一例急性白血病的免疫分型都是必不可少的。

白血病免疫分型对鉴别急淋和急非淋有决定作用，对鉴别急非淋的某些亚型如M7、M3也有决定作用，对于一些用形态学、细胞组织化学不能诊断的急性白血病，急性未分化白血病，混杂性白血病等有重要意义。

自从单克隆抗体问世以来,最成功的应用就是研究造血系统各类细胞表面抗原与细胞增殖、分化及恶变的关系。

研究发现细胞表面抗原有重要功能,一些抗原分子作为细胞生长因子的受体而影响细胞的增殖分化;一些抗原分子作为细胞间相互识别的物质基础而参与细胞间相互作用;一些抗原分子则是细胞特异功能的物质基础。

    从多能造血干细胞（PHSC）分化成熟为功能细胞过程中, 细胞表面和细胞浆内抗原随着分化成熟过程不断发生改变, 这些抗原称为造血细胞分化抗原。

造血细胞分化抗原是造血细胞分化过程中由细胞核内染色体上的基因编码的镶嵌蛋白, 其出现、增多、减少或消失与造血细胞分化密切相而表现出与细胞系列及分化程度相关的特异性。

这些抗原可作为鉴别和分类造血细胞的标记。

如髓系细胞的MPO、CD33、CD13、CD14、CD15等抗原;巨核系的CD41、CD41、CD61抗原; T淋巴细胞的CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8等抗原;B淋巴细胞的CD19、CD20、CD22等抗原。

至今尚未发现白血病细胞特异性抗原，而白血病细胞是造血细胞在某一分化阶段的大量积累,表达与之相应的造血细胞分化抗原，因此可用造血细胞分化抗原类标记检测白血病细胞; 但白血病细胞毕竟不是正常造血细胞,其抗原表达与正常造血细胞并不完全相同。

常有丢失某一分化发育阶段正常应有的抗原,或表达某一分化发育阶段正常不应有的抗原，或表达其他系列抗原，部分丧失了系列专一性和分化的严格性。

用FCM检测白血病免疫分型具有快速、简便、重复性好等优点。

由于FCM可根据FSCνSSC直方图区分细胞并可圈定检测细胞范围（Bitmap，无定型门）,或用SSC（线性或对数）和CD45直方图圈定检测细胞范围（Bitmap，无定型门），排除其他细胞干扰，因此较光学显微镜免疫荧光法或免疫组化法结果更准确。

十二. 流式细胞术在血液学中的应用   白血病免疫分型其临床意义

     目前公认的系列特异性指标是:

T淋巴细胞系--胞浆CD3（cCD3）,B淋巴细胞系-- cCD22或cCD79，髓系---MPO 或cCD13,一般可先用他们区分细胞系列后再进一步分析某一系列亚型和分化阶段。

1. ALL的免疫学分型

1986年前分为普通型ALL（cALL）、未分化细胞ALL （Null-ALL）、T细胞ALL（ T-ALL） 、前B细胞ALL （PreB-ALL）、B细胞ALL （B-ALL）五型;1986-1994年分为两大类九型（非T-ALL六型,T-ALL三型）,九十年代后期有人按临床实用性一般分为B祖细胞ALL、前B细胞ALL、B细胞ALL、T细胞ALL四型。

表12.1-表12.4列出ALL的五型、九型（ B细胞系列六型、T细胞系列三型）、四型分类法。

 B-祖细胞 ALL :

B-祖细胞ALL 占儿童ALL的65%-70%,青少年ALL的55%-60%,成人ALL的50%,儿童ALL >90%病例 CD10+，而婴儿CD10+病例<50%。

FAB分类为L1、L2，白血病细胞的FS和SS都很低;一般TdT、HLA-DR、CD19阳性，大多数病例CD24、CD34阳性，本型细胞膜免疫球蛋白（Ig）阴性。

此型有CD10+、CD10-两个亚型，CD10+型预后较CD10-型好。

前B 细胞ALL ：

前B 细胞ALL在发育阶段上较B祖细胞 ALL晚，占儿童ALL的25%，在成人ALL占的比例还不清楚。

一般CD24、HLA-DR、CD19、 CD10、cCD22阳性，CD34阴性,鉴别特点时有胞浆重链μ。

此型预后较B祖细胞ALL差，可能与t（1;19）有关，t（1;19）占前B 细胞ALL的25%，此型CD34-，而B系列ALL中CD34-是独立的预后不良标记。

B细胞ALL ：

B细胞ALL 占所有ALL 的2%-5%；B细胞ALL更为成熟，白血病细胞的FS和SS较B-祖细胞 ALL明显增加，在FSνSS直方图或SS（线性或对数）νCD45直方图中处于淋巴细胞和单核细胞区域。

典型标记是细胞膜免疫球蛋白（sIg）阳性,表型一般为CD19、CD20、CD22、CD24阳性,多数病例CD10+，但sIg和成熟抗原出现可区别于更早的B系ALL。

此型FAB分类一般为 L3,罕见病例有B细胞ALL标记而FAB分类一般为 L1，这些病人多有t（1;19）和t（14;18）。

T细胞ALL ：

T细胞ALL占儿童ALL的15%,成人ALL的25%。

多数表型为胸腺细胞型，最常见的是晚期胸腺皮质细胞亚型，CD1+、CD2+、CD5+、CD7+,CD4+CD8+，CD3表达较少，TdT常阳性；另一常见亚型是早期胸腺皮质细胞亚型，CD2+、CD5+、CD7+、TdT+。

髓质期亚型较少见，CD2+、CD5+、CD7+，CD3+CD4+或CD3+CD8+，TdT表达较少。

前T细胞亚型，仅有CD7和cCD3而无其他T系抗原表达，预后较差。

T系肿瘤性疾病多有特异性正常抗原表达的下调或表达该分化阶段正常不应出现的抗原。

成人T细胞ALL预后较好，而儿童T细胞ALL较儿童B-祖细胞 ALL和前B细胞 ALL预后差，虽然各亚类预后仍不甚明确，但CD10阴性者预后不良。

    ALL 的免疫学分型经过1986年前分为五型，1986-1994年分为两大类九型,九十年代后期（1997）分为四型的过程。

1986年前的五型，是当时单克隆抗体和检测手段的反映；随着新的单克隆抗体（主要是T、B淋巴细胞亚群的McAb）的发现和临床大量病例的检测，不仅弄清了T、B淋巴细胞的来源、分化发育过程，而且使免疫分型更加细致，因而出现了1986-1994年分为两大类九型；但按照细胞的分化发育阶段分型的两大类九型分型法对临床略显繁琐，指导治疗、判断预后临床实用性也不够强，因此又出现了以上简单的四型分类法。

经过对比不难看出，四型分类法的B-祖细胞ALL型实际上包含了两大类九型分类法的非T-ALL的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 3个亚型，而Ⅴ型即是前B 细胞ALL型，Ⅵ型是B 细胞ALL型；而T细胞ALL型是两大类九型中T-ALL的三型合并为一型。

两大类九型分类法的非T-ALL的Ⅰ型分类为急性未分化白血病（见后）。

ALL也可按DNA含量分类，用流式细胞仪很容易测定DNA含量，DNA含量分为两个亚类：

超二倍体和亚二倍体，前者预后好，后者预后差。

2.急性髓细胞白血病（AML）攪

目前所有粒、单核系的单克隆抗体基本无分化