原粮霉菌毒素检测手册.doc

1、原 粮 霉 菌 毒 素 检 测实用操作手册江苏省微生物研究所有限公司编制二六年四月无锡一、 样品的采集、制备及保存1、 样品的采集： 样品的概念：按照规定的方法及使用适当的工具，采取一定数量的具有代表整体质量的部分，以供分析检验用，该部分叫做样品。 采样的过程：检样 原始样品 平均样品 试验样品（试样）。 采样的类型：选择性采样；客观性采样。 采集后的处理：附上标签，注明名称、日期、数量、采样地点及方法，签封并登记。2、 样品的制备：原始样品的分取、粉碎、混匀、缩分的过程。注意防止成份的变化及交叉污染。常用的制备方法： 机械混匀法（四分法、分样器法）； 粉碎、过筛法； 研磨法； 搅拌法。3、

2、样品的保存： 当天采集的样品原则上当天测。 使用的容器应用2的次氯酸钠水溶液浸泡后，再洗干净晾干或烘干备用。 一般样品检验结束后保留样品1个月，以备复查。二、 待测液的制备1、 黄曲霉毒素B1待测液的制备：称量：准确称取5.0g均匀的粉碎样品；提取：用甲醇水（1:1）溶液25ml来振荡提取半小时，过滤；稀释：取滤液1ml，用甲醇水（1:1）进行稀释，记好稀释倍数； 储藏：稀释好的待测液直接进行检测或具塞小试管封存，放置冰箱中，避光保存，隔天检测（冰箱中放置最好不超过两天）。2、 呕吐毒素（DON）待测液的制备：称量：准确称取5.0g均匀的粉碎样品；提取：用甲醇水（1:9）溶液25ml来振荡提取

3、半小时，过滤；稀释：取滤液1ml，用甲醇水（1:9）进行稀释，记好稀释倍数； 储藏：稀释好的待测液直接进行检测或具塞小试管封存，放置冰箱中，避光保存，隔天检测（冰箱中放置最好不超过两天）。3、 玉米赤霉烯酮（ZEN）待测液的制备：称量：准确称取5.0g均匀的粉碎样品；提取：用甲醇水（7:3）溶液20ml来振荡提取半小时，过滤；稀释：取滤液1ml，用甲醇水（7:3）进行稀释，记好稀释倍数； 储藏：稀释好的待测液直接进行检测或具塞小试管封存，放置冰箱中，避光保存，隔天检测（冰箱中放置最好不超过两天）。三、 大量样品的集中初筛：1、黄曲霉毒素B1定性测定法。注意点：稀释：取滤液1ml，用甲醇水（1:

4、1）进行稀释，记好稀释倍数；依据国家对小麦（玉米、花生）中限量标准来进行适当稀释。比如：玉米中国家标准最大允许量为20ug/kg，那么滤液应稀释4倍。（允许量除以5）试剂的配制：酶标抗原，洗涤液。实验设计：截取相当数量的反应孔；设定三个对照孔（仪器调零孔，阴性对照孔，阳性对照孔（1.0ng/ml）；其余为样品孔（一般一次性测21个样品，以防操作时间过长带来的误差）。显色后先目测，比较样品孔和阳性孔的颜色，若阳性孔的颜色深于样品孔，则样品孔的浓度大于1.0，样品超标。加终止液，酶标仪测出吸光度，作为原始记录。2、呕吐毒素（DON）定性测定法。注意点： 稀释：取滤液1ml，用甲醇水（1:9）进行稀

5、释，记好稀释倍数；依据国家对小麦（玉米、大麦）中限量标准来进行适当稀释。比如：国家标准最大允许量为1000ug/kg，那么滤液应稀释2倍，与浓度为100ng/ml的标准点进行比较。 试剂的配制：酶标二抗，洗涤液，DON单克隆抗体。 实验设计：截取相当数量的反应孔；设定2个对照孔（阴性对照孔（0ng/ml），阳性对照孔（100ng/ml）；其余为样品孔（一般一次性测21个样品，以防操作时间过长带来的误差）。 洗涤：该实验中有两次洗涤，请严格按洗涤程序进行。 显色后先目测，比较样品孔和阳性孔的颜色，若阳性孔的颜色深于样品孔，则样品孔的浓度大于100，样品超标。 加终止液，酶标仪测出吸光度，作为原始

6、记录。3、玉米赤霉烯酮（ZEN）定性测定法。注意点： 稀释：取滤液1ml，用甲醇水（7:3）进行稀释，记好稀释倍数；依据国家对小麦、玉米中限量标准来进行适当稀释。比如：国家标准最大允许量为60ug/kg，那么滤液应稀释3倍，与浓度为5ng/ml的标准点进行比较。 试剂的配制：酶标二抗，洗涤液，DON单克隆抗体。 实验设计：截取相当数量的反应孔；设定2个对照孔（阴性对照孔（0ng/ml），阳性对照孔（5ng/ml）；其余为样品孔（一般一次性测21个样品，以防操作时间过长带来的误差）。 洗涤：该实验中有两次洗涤，请严格按洗涤程序进行。 显色后先目测，比较样品孔和阳性孔的颜色，若阳性孔的颜色深于样品

7、孔，则样品孔的浓度大于5，样品超标。加终止液，酶标仪测出吸光度，作为原始记录。四、 阳性样品的定量检测：1、黄曲霉毒素B1定量测定法，样品主要为超标样品，通常重新提取样品并制备待测液。注意点：稀释：取滤液1ml，用甲醇水（1:1）进行稀释，依据国家对小麦（玉米、花生）中限量标准来进行适当稀释。比如：玉米中国家标准最大允许量为20ug/kg，那么滤液本应稀释4倍（允许量除以5）。但是因超标，所以加大稀释倍数，一般将上述稀释液再进行稀释25倍即可。试剂的配制：酶标抗原，洗涤液。实验设计：截取相当数量的反应孔；设定标准曲线孔（0、0.1、0.5、1.0、5.0ng/ml）；其余为样品孔。酶标仪测出吸

8、光度，作为原始记录。 软件计算。2、呕吐毒素(DON)定量测定法，样品主要为超标样品，通常重新提取样品并制备待测液。注意点：稀释：取滤液1ml，用甲醇水（1:9）进行稀释，依据国家对小麦（玉米、大麦）中限量标准来进行适当稀释。比如：国家标准最大允许量为1000ug/kg，那么滤液本应稀释2倍。但是因超标，所以加大稀释倍数，一般将上述稀释液再进行稀释24倍即可。试剂的配制：酶标二抗，洗涤液，DON单克隆抗体。实验设计：截取相当数量的反应孔；设定标准曲线孔（0、10、100、500、1000ng/ml）；其余为样品孔。酶标仪测出吸光度，作为原始记录。软件计算。3、玉米赤霉烯酮(ZEN)定量测定法，

9、样品主要为超标样品，通常重新提取样品并制备待测液。注意点：稀释：取滤液1ml，用甲醇水（7:3）进行稀释，依据国家对小麦、玉米中限量标准来进行适当稀释。比如：国家标准最大允许量为60ug/kg，那么滤液本应稀释3倍。但是因超标，所以加大稀释倍数，一般将上述稀释液再进行稀释5倍即可。试剂的配制：酶标二抗，洗涤液，DON单克隆抗体。实验设计：截取相当数量的反应孔；设定标准曲线孔（0、1.0、2.5、5.0、10、50ng/ml）；其余为样品孔。酶标仪测出吸光度，作为原始记录。软件计算。五、 实验中注意事项：1、 水：请用实验室用水（蒸馏水）；2、 标准品或提取液使用前：摇匀；3、 移液器吸头不得重

10、复使用；4、 终止液加入后，轻轻振摇12分钟，然后测定吸光度值（因考虑到颜色变化有延迟时间）。5、 试剂保存：28冷藏，酶标二抗和单克隆抗体血清管需冷冻储存。6、 大量样品检测时，为避免操作时间过长而引起的误差，请尽量使用排式移液器。六、 软件计算中的问题：1、 软件绘制的曲线评价：A0.1/A0的值在30%左右，拟合的曲线上对应浓度和标准浓度的相对偏差在5以内。2、 软件计算中稀释倍数的确定：滤液的稀释倍数（D）；AFB1含量（g/kg）=CVDm式中： C-从标准曲线上查得的AFB1的含量（ng/ml） V-样品提取液体积(ml)； D-样品稀释倍数；m-样品的质量(g)。注：若软件中已经

11、将稀释倍数输入，则最后计算公式中不能将D再代入计算。七、 试剂盒集中采购，价格的优惠政策：1、 根据全国原粮卫生专项调查任务计划表来统计相应的试剂盒数量；2、 采购时请一定说明定量或定性检测试剂盒。3、 免费提供相关证书及资质证明。八、 粮食卫生标准GB2715-2005项目指标（g/kg）黄曲霉毒素B1玉米 大米 其他 20105脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）小麦、大麦、玉米及其成品粮1000玉米赤霉烯酮小麦、玉米 60赭曲霉毒素A谷类、豆类 5九、 参考资料1、原粮卫生检验技术培训教程2、黄曲霉毒素B1酶联免疫测试盒说明书3、呕吐毒素酶联免疫测试盒说明书4、玉米赤霉烯酮酶联免疫测试盒说明书5、粮食卫生标准十、 联系方式：051085500928（传真），85522291，85514690 编制：江苏省微生物研究所有限公司 测试盒项目部 2006-04-26