原粮霉菌毒素检测手册.doc
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原粮霉菌毒素检测
实
用
操
作
手
册
江苏省微生物研究所有限公司编制
二○○六年四月·无锡
一、样品的采集、制备及保存
1、样品的采集：
①样品的概念：
按照规定的方法及使用适当的工具，采取一定数量的具有代表整体质量的部分，以供分析检验用，该部分叫做样品。
②采样的过程：
检样原始样品平均样品试验样品（试样）。
③采样的类型：
选择性采样；客观性采样。
④采集后的处理：
附上标签，注明名称、日期、数量、采样地点及方法，签封并登记。
2、样品的制备：
原始样品的分取、粉碎、混匀、缩分的过程。
注意防止成份的变化及交叉污染。
常用的制备方法：
①机械混匀法（四分法、分样器法）；
②粉碎、过筛法；
③研磨法；
④搅拌法。
3、样品的保存：
①当天采集的样品原则上当天测。
②使用的容器应用2％的次氯酸钠水溶液浸泡后，再洗干净晾干或烘干备用。
③一般样品检验结束后保留样品1个月，以备复查。
二、待测液的制备
1、黄曲霉毒素B1待测液的制备：
①称量：
准确称取5.0g均匀的粉碎样品；
②提取：
用甲醇水（1:
1）溶液25ml来振荡提取半小时，过滤；
③稀释：
取滤液1ml，用甲醇水（1:
1）进行稀释，记好稀释倍数；
④储藏：
稀释好的待测液直接进行检测或具塞小试管封存，放置冰箱中，避光保存，隔天检测（冰箱中放置最好不超过两天）。
2、呕吐毒素（DON）待测液的制备：
①称量：
准确称取5.0g均匀的粉碎样品；
②提取：
用甲醇水（1:
9）溶液25ml来振荡提取半小时，过滤；
③稀释：
取滤液1ml，用甲醇水（1:
9）进行稀释，记好稀释倍数；
④储藏：
稀释好的待测液直接进行检测或具塞小试管封存，放置冰箱中，避光保存，隔天检测（冰箱中放置最好不超过两天）。
3、玉米赤霉烯酮（ZEN）待测液的制备：
①称量：
准确称取5.0g均匀的粉碎样品；
②提取：
用甲醇水（7:
3）溶液20ml来振荡提取半小时，过滤；
③稀释：
取滤液1ml，用甲醇水（7:
3）进行稀释，记好稀释倍数；
⑤储藏：
稀释好的待测液直接进行检测或具塞小试管封存，放置冰箱中，避光保存，隔天检测（冰箱中放置最好不超过两天）。
三、大量样品的集中初筛：
1、黄曲霉毒素B1定性测定法。
注意点：
①稀释：
取滤液1ml，用甲醇水（1:
1）进行稀释，记好稀释倍数；依据国家对小麦（玉米、花生）中限量标准来进行适当稀释。
比如：
玉米中国家标准最大允许量为20ug/kg，那么滤液应稀释4倍。
（允许量除以5）
②试剂的配制：
酶标抗原，洗涤液。
③实验设计：
截取相当数量的反应孔；设定三个对照孔（仪器调零孔，阴性对照孔，阳性对照孔（1.0ng/ml））；其余为样品孔（一般一次性测21个样品，以防操作时间过长带来的误差）。
④显色后先目测，比较样品孔和阳性孔的颜色，若阳性孔的颜色深于样品孔，则样品孔的浓度大于1.0，样品超标。
⑤加终止液，酶标仪测出吸光度，作为原始记录。
2、呕吐毒素（DON）定性测定法。
注意点：
①稀释：
取滤液1ml，用甲醇水（1:
9）进行稀释，记好稀释倍数；依据国家对小麦（玉米、大麦）中限量标准来进行适当稀释。
比如：
国家标准最大允许量为1000ug/kg，那么滤液应稀释2倍，与浓度为100ng/ml的标准点进行比较。
②试剂的配制：
酶标二抗，洗涤液，DON单克隆抗体。
②实验设计：
截取相当数量的反应孔；设定2个对照孔（阴性对照孔（0ng/ml），阳性对照孔（100ng/ml））；其余为样品孔（一般一次性测21个样品，以防操作时间过长带来的误差）。
③洗涤：
该实验中有两次洗涤，请严格按洗涤程序进行。
④显色后先目测，比较样品孔和阳性孔的颜色，若阳性孔的颜色深于样品孔，则样品孔的浓度大于100，样品超标。
⑥加终止液，酶标仪测出吸光度，作为原始记录。
3、玉米赤霉烯酮（ZEN）定性测定法。
注意点：
④稀释：
取滤液1ml，用甲醇水（7:
3）进行稀释，记好稀释倍数；依据国家对小麦、玉米中限量标准来进行适当稀释。
比如：
国家标准最大允许量为60ug/kg，那么滤液应稀释3倍，与浓度为5ng/ml的标准点进行比较。
②试剂的配制：
酶标二抗，洗涤液，DON单克隆抗体。
⑤实验设计：
截取相当数量的反应孔；设定2个对照孔（阴性对照孔（0ng/ml），阳性对照孔（5ng/ml））；其余为样品孔（一般一次性测21个样品，以防操作时间过长带来的误差）。
⑥洗涤：
该实验中有两次洗涤，请严格按洗涤程序进行。
④显色后先目测，比较样品孔和阳性孔的颜色，若阳性孔的颜色深于样品孔，则样品孔的浓度大于5，样品超标。
⑤加终止液，酶标仪测出吸光度，作为原始记录。
四、阳性样品的定量检测：
1、黄曲霉毒素B1定量测定法，样品主要为超标样品，通常重新提取样品并制备待测液。
注意点：
①稀释：
取滤液1ml，用甲醇水（1:
1）进行稀释，依据国家对小麦（玉米、花生）中限量标准来进行适当稀释。
比如：
玉米中国家标准最大允许量为20ug/kg，那么滤液本应稀释4倍（允许量除以5）。
但是因超标，所以加大稀释倍数，一般将上述稀释液再进行稀释2~5倍即可。
②试剂的配制：
酶标抗原，洗涤液。
③实验设计：
截取相当数量的反应孔；设定标准曲线孔（0、0.1、0.5、1.0、5.0ng/ml）；其余为样品孔。
④酶标仪测出吸光度，作为原始记录。
⑦软件计算。
2、呕吐毒素（DON）定量测定法，样品主要为超标样品，通常重新提取样品并制备待测液。
注意点：
①稀释：
取滤液1ml，用甲醇水（1:
9）进行稀释，依据国家对小麦（玉米、大麦）中限量标准来进行适当稀释。
比如：
国家标准最大允许量为1000ug/kg，那么滤液本应稀释2倍。
但是因超标，所以加大稀释倍数，一般将上述稀释液再进行稀释2~4倍即可。
②试剂的配制：
酶标二抗，洗涤液，DON单克隆抗体。
③实验设计：
截取相当数量的反应孔；设定标准曲线孔（0、10、100、500、1000ng/ml）；其余为样品孔。
④酶标仪测出吸光度，作为原始记录。
⑤软件计算。
3、玉米赤霉烯酮（ZEN）定量测定法，样品主要为超标样品，通常重新提取样品并制备待测液。
注意点：
①稀释：
取滤液1ml，用甲醇水（7:
3）进行稀释，依据国家对小麦、玉米中限量标准来进行适当稀释。
比如：
国家标准最大允许量为60ug/kg，那么滤液本应稀释3倍。
但是因超标，所以加大稀释倍数，一般将上述稀释液再进行稀释5倍即可。
②试剂的配制：
酶标二抗，洗涤液，DON单克隆抗体。
③实验设计：
截取相当数量的反应孔；设定标准曲线孔（0、1.0、2.5、5.0、10、50ng/ml）；其余为样品孔。
④酶标仪测出吸光度，作为原始记录。
⑤软件计算。
五、实验中注意事项：
1、水：
请用实验室用水（蒸馏水）；
2、标准品或提取液使用前：
摇匀；
3、移液器吸头不得重复使用；
4、终止液加入后，轻轻振摇1~2分钟，然后测定吸光度值（因考虑到颜色变化有延迟时间）。
5、试剂保存：
2~8℃冷藏，酶标二抗和单克隆抗体血清管需冷冻储存。
6、大量样品检测时，为避免操作时间过长而引起的误差，请尽量使用排式移液器。
六、软件计算中的问题：
1、软件绘制的曲线评价：
A0.1/A0的值在30%左右，拟合的曲线上对应浓度和标准浓度的相对偏差在5％以内。
2、软件计算中稀释倍数的确定：
滤液的稀释倍数（D）；
AFB1含量（µg/kg）=
C×V×D
m
式中：
C------从标准曲线上查得的AFB1的含量（ng/ml）
V------样品提取液体积（ml）；
D------样品稀释倍数；
m------样品的质量（g）。
注：
若软件中已经将稀释倍数输入，则最后计算公式中不能将D再代入计算。
七、试剂盒集中采购，价格的优惠政策：
1、根据《全国原粮卫生专项调查任务计划表》来统计相应的试剂盒数量；
2、采购时请一定说明定量或定性检测试剂盒。
3、免费提供相关证书及资质证明。
八、《粮食卫生标准》GB2715-2005
项目
指标（μg/kg）
黄曲霉毒素B1
玉米≤
大米≤
其他≤
20
10
5
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）
小麦、大麦、玉米及其成品粮≤
1000
玉米赤霉烯酮
小麦、玉米≤
60
赭曲霉毒素A
谷类、豆类≤
5
九、参考资料
1、《原粮卫生检验技术培训教程》
2、《黄曲霉毒素B1酶联免疫测试盒说明书》
3、《呕吐毒素酶联免疫测试盒说明书》
4、《玉米赤霉烯酮酶联免疫测试盒说明书》
5、《粮食卫生标准》
十、联系方式：
0510－85500928（传真），85522291，85514690
编制：
江苏省微生物研究所有限公司
测试盒项目部
2006-04-26
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