TLR4 基因敲除对小鼠内脏脂肪组织免疫细胞及脂肪因子的影响化学生物毕业论文.docx

1、TLR4 基因敲除对小鼠内脏脂肪组织免疫细胞及脂肪因子的影响化学生物毕业论文-文档均为word文档，下载后可直接编辑使用亦可打印-TLR4 基因敲除对小鼠内脏脂肪组织免疫细胞及脂肪因子的影响摘 要背景 大量研究表明，肥胖、胰岛素抵抗患者呈现低水平的炎症反应，慢性炎症是导致胰岛素抵抗的一个重要原因。Toll 样受体 4（Toll-like receptor4, TLR4）是模式识别受体 Toll样受体家族的一个成员，在病原识别和固有免疫反应中发挥重要作用。最近研究发现，TLR4 不仅参与病原微生物入侵的天然免疫应答，许多无菌的炎症导致的疾病，包括肥胖的发生、发展及预后，同样与TLR4 信号有关。

2、目的探讨TLR4 基因敲除对小鼠免疫细胞及脂肪因子的影响。方法取20 周龄的雄性野生型C57BL/6 小鼠和TLR4-/ -小鼠的脾脏和附睾脂肪组织,分离细胞,用流式检测F4/80、CD11b、CD11c、CD3、CD4、CD8 分子的表达;qPCR 检测附睾脂肪组织内IL鄄6、HMGB1、TNF鄄琢、脂联素和抵抗素的表达。结果与野生型C57BL/6 小鼠相比,TLR4-/ - 小鼠脾脏和附睾脂肪组织中M1 型(F4/80+ CD11b+ CD11c+ )巨噬细胞比例上升(P0.05),M2 型(F4/80+ CD11b+ CD11c)巨噬细胞比例下降(P0.05),这种趋势在附睾脂肪组织中表

3、现更为显著。同时发现附睾脂肪组织中CD4+ T 细胞比例下降(P0.05),CD8+ T细胞比例上升(P0.05);IL-6、HMGB1、抵抗素表达升高(P0.05);TNF-和脂联素表达降低(P0.05)结论TLR4 基因敲除可导致内脏脂肪组织脂肪因子和免疫细胞的紊乱。关键词：TLR4 基因；基因敲除；脂肪细胞；免疫细胞；紊乱The effects of TLR4 gene knockout on immune cells and adipokines in visceral adipose tissue of mice productionAbstractBackground A larg

4、e number of studies have shown that obesity, insulin resistance in patients with low levels of inflammatory response, chronic inflammation is an important cause of insulin resistance. Toll-like receptor 4 (Toll-like receptor4, TLR4) is a member of the Toll-like receptor family of pattern recognition

5、 receptors and plays an important role in pathogen recognition and innate immune responses. Recent studies have found that TLR4 is not only involved in the natural immune response of pathogenic microbial invasion, many of the diseases caused by sterile inflammation, including obesity, development an

6、d prognosis, the same with the TLR4 signal.ObjectiveTo investigate the effect of TLR4 knockout on immune cells and adipokines in mice.MethodsTake 20 weeks old male wild type C57BL / 6 smallThe expression of F4 / 80, CD11b, CD11c, CD3, CD4, CD8 was detected by flow cytometry in the spleen and epididy

7、mal adipose tissue of TLR4 / - mice.The expression of IL-6, HMGB1, TNF-cut, adiponectin and resistin in adipose tissue of epididymis were measured.ResultsCompared with wild-type C57BL / 6 mice, the proportion of M1 (F4 / 80 + CD11b + CD11c +) macrophages in the spleen and epididymal adipose tissue o

8、f TLR4 / - mice increased (P 0.05), M2 (F4 / 80 + CD11b + CD11c) macrophages decreased (P 0.05), this trend in the epididymal adipose tissue performance was more significant. (P 0.05). The expression of IL-6, HMGB1 and resistin was increased (P 0.05), TNF- and lipids (P 0.05)ConclusionTLR4 knockout

9、can lead to visceral adipose tissue adipokines and immune cell disorders. Keywords: TLR4 gene; gene knockout; adipocytes; immune cells前言肥胖相关的慢性炎症是内脏脂肪组织发生胰岛素抵抗的始动因素。脂肪的过渡积累引起人或动物的肥胖,进而诱发多种代谢紊乱疾病,其中二型糖尿病与之关系最为密切。高脂饮食是肥胖发生的重要危险因素，但是高脂饮食条件下，并不是所有的个体都发生肥胖，而一部分发生肥胖，而另外一部分表现出了肥胖抵抗，目前相关的机制还未完全阐明。最近研究发现，高脂饮

10、食与下丘脑炎性反应密切相关。下丘脑炎性因子表达的增加可以导致胰岛素和瘦素抵抗，从而引起机体的摄食紊乱和体重的增加。研究表明,过多的脂肪积累引起脂肪及肝脏等组织呈现慢性低度炎症反应。内脏脂肪组织应激导致脂肪细胞凋亡或坏死。凋亡的脂肪细胞被巨噬细胞识别。巨噬细胞经表面的Toll样受体(TLR)与脂肪酸及凋亡碎片相互作用并被激活。Toll 样受体( Toll-likereceptors,TLRs)是一类主要的模式识别受体, TLR能结合机体自身产生的一些内源性分子（即内源性配体）。免疫佐剂可增强抗肿瘤免疫，其分子和细胞机制得到进一步阐明TLR也在其中扮演重要角色。由于肿瘤在发生发展过程中可以产生一些

11、能被TLR识别的内源性配体，所以TLR在肿瘤免疫监视中可能发挥了一定作用。Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）家族是一种具有固有免疫作用，并在低度慢性炎症中扮演着重要角色的一种传递炎症信号的门户蛋白。目前认为他与胰岛素抵抗的形成及 2 型糖尿病的发生、发展有着密切的联系。它不但能够识别病原相关分子模式，而且与机体的抗感染免疫反应也有十分密切的关系。Toll 样受体能够结合其相对应的配体，继而可以产生信号转导，启动其参与的多个炎症反应相关的基因转录，从而释放炎症因子，参与炎症反应，在低度炎症及免疫反应中发挥着其重要作用。目前认为 TLR4 及 TLR2 是在其家族

12、中占有重要地位，在固有免疫及炎症免疫中扮演着重要的角色，目前已证实分布在脂肪组织、肌肉、肝脏等组织中的 Toll受体 4 参与胰岛素的抵抗。目前认为 Toll 受体 4 主要是通过炎症反应参与其中的。目前研究显示我们人体内存在着大量的 Toll 受体的配体，他主要包括内源性及外源性两种。有学者认为脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是 Toll 受体的外源性配体的典型代表。Toll 受体的内源性配体主要包括游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）、热休克蛋白、黏多糖降解产物、高糖、血管外的纤维素等。目前认为即使没有以脂多糖代表的外源性配体，这些内源性配体也能够激活

13、 TLR4 介导的炎症反应通路。进而产生低度炎症反应及固有免疫反应。TLRs 下游十分重要的信号分子是有一种叫做 NF-k B 的转录因子，在免疫炎症基因调节中起着很重要的作用，同时对炎症因子的分泌也起着关键的调节作用。（这句话是什么意思）目前有学者认为：TLR4/NF-B 信号通路可能受连接天然免疫、脂肪代谢、胰岛素抵抗以及血管炎症和动脉硬化的一个枢纽。当然TLR4/NF-B 信号通路不是唯一的炎症过程，人体内还有一些其他的炎症信号通路参与，c-Jun 氨基末端激酶信号通路和 p38MAPK 信号通路也参与了炎症反应，但是TLR4/NF-B 信号通路是被认为最重要的炎症反应通路。有很多研究1

14、0，都提示他与胰岛素级糖尿病的形成是有很重要的关系的。我们知道 2 型糖尿病是一种多基因控制的疾病，TLR4/NF-B 等介导固有免疫反应的信号通路的基因突变可能与 2 型糖尿病的危险因素的代谢表型有关，可能参与 2 型糖尿病的形成。目前在哺乳动物中已经发现的TLR 有13 种 。TLR4是最早发现也是研究最深入的TLR,主要分布在单核细胞、巨噬细胞、NK 细胞和脂肪细胞的胞膜上,与配体结合后可通过NF- kB 信号途径生成并释放大量的促炎细胞因子。Toll样受体胞膜外区主要行使识别受体及与其他辅助受体(co-receptor)结合形成受体复合物的功能。Toll样受体的胞浆区与IL-1R家族成

15、员胞浆区高度同源(IL-1R介导的信号传导系统和机制与果蝇类似)，该区称为Toll-IL-1受体结构域(Toll-IL-1 receptor domain，TIR结构域)。TIR具有嗜同性相互作用(homophilic interaction)，藉此来募集下游含有TIR的信号分子，组成信号复合体。但是二者胞外部分不相关，TLR胞膜外区为有17个31个亮氨酸富集的重复序列(Leucine rich repeats，LRRs)，并且都含有3个胞外段辅助蛋白即MD-1、MD-2和RP105，参与对疾病相关分子模式（PAMP）的识别；而IL-1R为Ig样的结构，在哺乳动物中，一些胞浆蛋白也存在TIR域

16、，如2种信号接受蛋白，MyD88和TIR域的接受子蛋白(TIR domain-containing adaptor protein，TIRAP)，二者在TIR信号传导中起作用。引至何处Toll 样受体-4（Toll like receptor 4，TLR4）作为保守的模式识别受体，在机体的免疫调控中有着重要作用。脑室注入饱和脂肪酸可以显著增加下丘脑 TLR4 和相关炎性基因的表达，TLR4 抗体干预可逆转高脂饮食诱导的下丘脑炎性反应和胰岛素抵抗并降低食物的摄入量。核因子-B (Nuclear factor-B, NF-B)作为 TLR4 的下游信号分子，在机体的炎性反应中起着关键的作用。最新研

17、究发现 NF-B 与下丘脑的胰岛素和瘦素抵抗也密切相关。利用外源性载体激活下丘脑的 NF-B 可以引起下丘脑的胰岛素和瘦素敏感性降低，导致小鼠的摄食增加，而同样的方法抑制下丘脑 NF-B 的活性后可使肥胖小鼠的摄食量降低，体重减轻。以上研究提示高脂饮食诱导的下丘脑炎性反应在机体的摄食紊乱和肥胖的发生中起着重要的作用。同样高脂饮食条件下，肥胖抵抗大鼠是否可以通过抑制下丘脑的炎性反应从而阻止肥胖的发生，目前还没有相关的报道。近年来研究表明食物中的饱和脂肪酸可通过与TLR4 结合激活相关信号通路,若缺失TLR4 基因,可缓解高脂饮食诱导的小鼠肥胖和胰岛素抵抗的发生 。但TLR4 基因缺失的小鼠其内脏

18、脂肪组织中免疫细胞及脂肪因子如何改变少见报道,本研究探讨TLR4 基因敲除对小鼠附睾脂肪组织中免疫细胞及脂肪因子的影响。脂肪组织在肥胖个体伴随的炎性反应有着极其重要的作用，脂肪细胞与免疫细胞相互作用促进炎性因子分泌的增加，进一步研究发现脂肪组织中的巨噬细胞是炎性因子分泌的主要来源，伴随着巨噬细胞浸润的增加，炎性因子分泌增加。在介导巨噬细胞迁移和聚集的因素中，骨桥蛋白（osteopontin，OPN）因其较强的粘附趋化能力及在细胞迁移过程中的重要作用而备受关注。另一项研究发现，高脂饮食条件下，OPN-/-小鼠与野生型小鼠相比体重无显著变化，但是胰岛素敏感性却显著增加，静脉注入 OPN 抗体可以明

19、显改善饮食诱导肥胖小鼠的胰岛素敏感性。上述研究案例暗示我们： OPN 介导的脂肪组织炎性反应在高脂饮食诱导的胰岛素抵抗的发生中起着重要的作用。但 OPN 介导的脂肪组织炎性反应是否参与了脂肪酸类型不同高脂饮食诱导的肥胖大鼠的胰岛素敏感性差异，目前尚不清楚。这个是结论吗？和我的论文结论是不是冲突了1 实验材料1.1 实验对象C57BL/6小鼠:SPF级，36只，雄性，出生第21d(3周龄)，体重量(12.50.5g)，TLR4-/ - 小鼠由北京协和医学院韩代书教授馈赠;小鼠常规饲养,保持室内温度在22益 26益,湿度40% 60%,随意自由饮水和给予标准饲料进食。实验过程中对动物的饲养及取材均

20、遵守实验动物管理及保护的相关规定。1.2 实验仪器Fresco 21 型低温高速离心机 Thermo 美国702 型-80超低温冰箱 Thermo 美国微量可调移液器 Gilson 法国倍易型血糖仪 强生 中国XB70 型制冰机 GRANT 中国SW-CJ-lf 型超净工作台 苏州净化设备公司 中国TGL-16B 型高速台式离心机 上海飞鸽 中国XH-C 型旋涡混匀器 江苏金怡 中国HDB-PLUs 型恒温金属浴 HEROS 中国DYY-7C 型水平电泳仪 北京六一 中国75S /00771 型凝胶成像系统 BIO-RAD 美国YP402N 型电子称 上海精科 中国PHS-3C 型台式 ph

21、计 上海精科 中国Nano Drop 2000 分光光度计 Thermo 美国DHG-9240AS 型电热鼓风干燥箱 上海博迅 中国721 型分光光度计 上海光学仪器 中国Agilent 2100 生物分析仪 安捷伦 美国Agilent G2505C 扫描仪 安捷伦 美国Agilent G2545A 杂交炉 安捷伦 美国97 型 PCR 仪 ABI 美国7600-110 全自动生化分析仪 日立 日本1.3 实验试剂1.3.1 生化指标试剂 强生血糖试纸：强生医疗器械有限公司，上海； 丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒：第一化学药品株式会社，日本； 血糖(GLU)测定试剂盒：第一化学药品株式会

22、社，日本； 甘油三酯(TG)测定试剂盒：第一化学药品株式会社，日本； 总胆固醇(TC)测定试剂盒：第一化学药品株式会社，日本； 低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测定试剂盒：第一化学药品株式会社，日本； 高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测定试剂盒：第一化学药品株式会社，日本；1.3.2 Western blot主要试剂三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 美国 sigma 公司丙烯酰胺 美国 sigma 公司十二烷基硫酸钠 (SDS) 美国 sigma 公司过硫氨酸 (APS) 美国 sigma 公司溴酚兰 美国 sigma 公司四甲基乙二胺 (TEMED) 美国 sigma 公司-巯基乙醇 美国 s

23、igma 公司Tween-20 美国 Amresco 公司甘氨酸 美国 Amresco 公司亚甲叉双丙烯酰胺 美国 Amresco 公司BCA 蛋白检测试剂盒(cat#PQ0011) 浙江联科生物技术有限公司小鼠抗小鼠 TLR4 抗体(cat#76B357.1) 英国 abcam 公司小鼠抗小鼠-actin 抗体(cat#BM062) 武汉博士德生物技术有限公司山羊 抗小 鼠 Ig G (H+L) ，HRP 试剂 盒 (cat#CW0102) 美 国Rockland浓盐酸 天津化学试剂三厂丙三醇(甘油) 天津化学试剂三厂甲醇 天津化学试剂三厂小鼠淋巴细胞分离液(cat#DKW33-R0100)

24、 深圳达科为生物技术有限公司总蛋白提取试剂盒(cat#P1250) 北京普利莱公司Potent ECL 高敏化学发光试剂盒(cat#P142S) 浙江联科生物技术有限公司1.3.3 其他试剂 TAK-242，购于上海皓元生物科技有限公司(cat#HY-11109) 琼脂糖，购于美国 Medchem Express； 冰乙酸、无水乙醇、硼酸、EDTA 等试剂为分析纯试剂，购于上海生物工程公司和北京鼎国公司 mir Vana TM RNA Isolation Kit (Applied Biosystem p/n AM1556 ),总 RNA 提取试剂1.4 主要试剂调配1.4.1 1M Tris-

25、Hcl (p H6.8)称取 Tris 60.57 g，加双蒸水 430 ml，充分搅拌溶解，用浓盐酸（原液）滴定至 p H6.8，再加入双蒸水定容至 500ml。1.4.2 1M Tris-Hcl (p H.8)称取 Tris 60.57 g，加双蒸水 430 ml，充分搅拌溶解，用浓盐酸（原液）滴定至 p H8.8，再加入双蒸水定容至 500ml。1.4.3 10APS称取 l.0g APS 溶于 10 ml 双蒸水中，混匀，4避光保存。1.4.4 30丙烯酰胺称取 1.0 g 亚甲叉双丙烯酰胺和 29.0 g 丙烯酰胺溶于双蒸水中，总体积为 60 ml，再加热至 37溶解，最后加双蒸水定

26、容至 100 ml，避光 4保存。1.4.5 10SDS称取 10.0 mg SDS 溶于 90 ml 双蒸水中，再加热到 68充分溶解，加双蒸水定容至 100 ml，放于 4保存。1.4.6 8分离胶1 M Tris-Hcl (p H=8.8) 2.5 ml30丙烯酰胺 2.7 m1双蒸水 1.4.6 ml10SDS 100 l10APS 100 lTEMED 6 l1.4.7 12分离胶1 M Tris-Hcl (p H=8.8) 2.5 ml30丙烯酰胺 1.4.0 m1双蒸水 3.3 ml10SDS 100 l10APS 100 lTEMED 4 l1.4.8 5浓缩胶1 M Tris

27、-Hcl (p H=6.8) 0.375 ml30丙烯酰胺 0.5 ml双蒸水 2.06 ml10SDS 30 l10APS 30 lTEMED 3 l1.4.9 TPBS 缓冲液0.01 M PBS 250 mlTween-20 250 l充分混匀1.4.10 电泳工作液电泳储存液 95 ml1 0SDS 5 m1加双蒸水定容至 500 ml1.4.11 电泳储存液甘氨酸 47.0 gTris 7.55 g加双蒸水定容至 500 ml1.4.12 转膜缓冲储备液甘氨酸 11.4.5 gSDS 1.85 gTris 29.0 g加双蒸水定容至 500 ml1.4.13 转膜缓冲液工作液转膜缓冲

28、液储存液 100 ml甲醇 200 ml加双蒸水定容至 1000 ml1.4.14 封闭液伊利脱脂奶粉 2.0 g0.01M PBS 40 ml1.4.15 Loading buffer1M Tris-Hcl (p H=6.8) 2.5 ml溴酚蓝 50.0 mgSDS 1.0 g甘油 5.0 ml加双蒸水定容至 10 ml 溶解，放于室温保存，使用前加入-巯基乙醇(1:20)。1.4.16 DEPC 水：取双蒸水 1000 ml，15 磅高压灭菌 15 min，加入 DEPC1ml，充分混匀并 4过夜，于 15 磅高压灭菌 15 min，备用。1.4.17 TAK-242 贮存液：准确称取

29、5.0mg TAK-242，用 2.5ml DMSO溶解，完全溶解后，分装在 EP 管中，每管 50l 及 10l（10l 的50l 管即可），储存液每l 含 2g TAK-242（2g/l），无菌分装，储存于-80。1.4.18 TAK-242 应用液：取储存液，短暂离心，根据需要量，用无菌生理盐水做适当稀释。2 实验方法2.1 动物培养与分组大鼠适应性饲养 1 周后，按体重随机分为 2 组，正常对照组(10 只)，喂以基础饲料,高脂饲料组（45 只），喂养猪油为主要脂肪成分配制的高脂饲料；各组大鼠均单笼饲养，自由摄食和饮水，动物房温度（202），相对湿度(5010)%，明暗周期 12 比

30、12。第 10 周时，高脂实验组大鼠体重基本稳定，参照对照组大鼠的平均体重及标准差，将高脂饲料组大鼠分为 DIO大鼠(体重大于对照组平均体重加 1.96 倍标准差)和 DIO-R大鼠(体重小于对照组平均体重加 1倍标准差)，体重介于二者之间的大鼠不纳入本次研究。饲养条件：小鼠于空调温控动物室饲养，温度 2024，相对湿度50%60%，照明度为 280350LX，光照节律为明/暗 12h 交替，小鼠自由摄食、饮水。1.2 饲料： 基础饲料：由河北北方学院动物室提供，配方为：普通面粉 20%、玉米面粉 40%、豆粉 20%、大麦麸皮 6%、骨粉 5%、鱼粉 8%、鱼肝油 1%。 高脂饲料：由河北北

31、方学院动物室制作，配方为：基础饲料 53%、猪油 10%、奶粉 5%、鸡蛋 11%、白糖 5%、黄豆 16%。2.1.1 动物分组45 只刚断乳（出生 21d）的雄性 C57BL/6 小鼠，体重 12.50.5g，以基础饲料适应性饲养 3 天。第 4 天（出生 25d），随机抽取 17 只小鼠作为正常对照组，以普通基础饲料喂养（low fat diet,LFD）；其余 28 只作为高脂实验组，给予高脂饲料喂养（high fat diet,HFD）。2.1.2 建立胰岛素抵抗小鼠模型小鼠饲养期间，每日称量记录饲料余量，了解小鼠进食状况；每周称量小鼠体重一次，以记录生长曲线。当高脂饲料饲养组小鼠与

32、基础饲料饲养组小鼠的体重有显著差异时，行葡萄糖耐量实验（glucose tolerance test, GTT）和胰岛素耐量实验（insulin tolerancetest, ITT），观察小鼠胰岛素抵抗的发生。2.1.3 葡萄糖耐量实验小鼠禁食 12h 后，测定小鼠体重，按 2.0g 葡萄糖kg 体重计算，腹腔注射 25%的葡萄糖，应用血糖仪测定注射前和注射后 30、60、90、120min 的小鼠尾静脉血糖值，观察正常对照组 LFD 组、高脂饮食组 HFD 组小鼠在注射葡萄糖前后各时间点血糖浓度的变化。2.1.4 胰岛素耐量实验小鼠行 GTT 后，间隔 1 周，进行 ITT 实验。小鼠禁食 12h 后，测定