TLR4 基因敲除对小鼠内脏脂肪组织免疫细胞及脂肪因子的影响化学生物毕业论文.docx

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TLR4基因敲除对小鼠内脏脂肪组织免疫细胞及脂肪因子的影响化学生物毕业论文

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TLR4基因敲除对小鼠内脏脂肪组织免疫细胞及脂肪因子的影响

摘要

背景

大量研究表明，肥胖、胰岛素抵抗患者呈现低水平的炎症反应，慢性炎症是导致胰岛素抵抗的一个重要原因。

Toll样受体4（Toll-likereceptor4,TLR4）是模式识别受体Toll样受体家族的一个成员，在病原识别和固有免疫反应中发挥重要作用。

最近研究发现，TLR4不仅参与病原微生物入侵的天然免疫应答，许多无菌的炎症导致的疾病，包括肥胖的发生、发展及预后，同样与TLR4信号有关。

目的

探讨TLR4基因敲除对小鼠免疫细胞及脂肪因子的影响。

方法

取20周龄的雄性野生型C57BL/6小鼠和TLR4-/-小鼠的脾脏和附睾脂肪组织,分离细胞,用流式检测F4/80、CD11b、CD11c、CD3、CD4、CD8分子的表达;qPCR检测附睾脂肪组织内IL鄄6、HMGB1、TNF鄄琢、脂联素和抵抗素的表达。

结果

与野生型C57BL/6小鼠相比,TLR4-/-小鼠脾脏和附睾脂肪组织中M1型（F4/80+CD11b+CD11c+）巨噬细胞比例上升（P<0.05）,M2型（F4/80+CD11b+CD11c）巨噬细胞比例下降（P<0.05）,这种趋势在附睾脂肪组织中表现更为显著。

同时发现附睾脂肪组织中CD4+T细胞比例下降（P<0.05）,CD8+T细胞比例上升（P<0.05）;IL-6、HMGB1、抵抗素表达升高（P<0.05）;TNF-α和脂联素表达降低（P<0.05）

结论

TLR4基因敲除可导致内脏脂肪组织脂肪因子和免疫细胞的紊乱。

关键词：

TLR4基因；基因敲除；脂肪细胞；免疫细胞；紊乱

TheeffectsofTLR4geneknockoutonimmunecellsandadipokinesinvisceraladiposetissueofmiceproduction

Abstract

Background

Alargenumberofstudieshaveshownthatobesity,insulinresistanceinpatientswithlowlevelsofinflammatoryresponse,chronicinflammationisanimportantcauseofinsulinresistance.Toll-likereceptor4（Toll-likereceptor4,TLR4）isamemberoftheToll-likereceptorfamilyofpatternrecognitionreceptorsandplaysanimportantroleinpathogenrecognitionandinnateimmuneresponses.RecentstudieshavefoundthatTLR4isnotonlyinvolvedinthenaturalimmuneresponseofpathogenicmicrobialinvasion,manyofthediseasescausedbysterileinflammation,includingobesity,developmentandprognosis,thesamewiththeTLR4signal.

Objective

ToinvestigatetheeffectofTLR4knockoutonimmunecellsandadipokinesinmice.

Methods

Take20weeksoldmalewildtypeC57BL/6small

TheexpressionofF4/80,CD11b,CD11c,CD3,CD4,CD8wasdetectedbyflowcytometryinthespleenandepididymaladiposetissueofTLR4/-mice.

TheexpressionofIL-6,HMGB1,TNF-cut,adiponectinandresistininadiposetissueofepididymisweremeasured.

Results

Comparedwithwild-typeC57BL/6mice,theproportionofM1（F4/80+CD11b+CD11c+）macrophagesinthespleenandepididymaladiposetissueofTLR4/-miceincreased（P<0.05）,M2（F4/80+CD11b+CD11c）macrophagesdecreased（P<0.05）,thistrendintheepididymaladiposetissueperformancewasmoresignificant.（P<0.05）.TheexpressionofIL-6,HMGB1andresistinwasincreased（P<0.05）,TNF-αandlipids（P<0.05）

Conclusion

TLR4knockoutcanleadtovisceraladiposetissueadipokinesandimmunecelldisorders.

Keywords:

TLR4gene;geneknockout;adipocytes;immunecells

前言

肥胖相关的慢性炎症是内脏脂肪组织发生胰岛素抵抗的始动因素。

脂肪的过渡积累引起人或动物的肥胖,进而诱发多种代谢紊乱疾病,其中二型糖尿病与之关系最为密切。

高脂饮食是肥胖发生的重要危险因素，但是高脂饮食条件下，并不是所有的个体都发生肥胖，而一部分发生肥胖，而另外一部分表现出了肥胖抵抗，目前相关的机制还未完全阐明。

最近研究发现，高脂饮食与下丘脑炎性反应密切相关。

下丘脑炎性因子表达的增加可以导致胰岛素和瘦素抵抗，从而引起机体的摄食紊乱和体重的增加。

研究表明,过多的脂肪积累引起脂肪及肝脏等组织呈现慢性低度炎症反应。

内脏脂肪组织应激导致脂肪细胞凋亡或坏死。

凋亡的脂肪细胞被巨噬细胞识别。

巨噬细胞经表面的Toll样受体（TLR）与脂肪酸及凋亡碎片相互作用并被激活。

Toll样受体（Toll-likereceptors,TLRs）是一类主要的模式识别受体,TLR能结合机体自身产生的一些内源性分子（即内源性配体）。

免疫佐剂可增强抗肿瘤免疫，其分子和细胞机制得到进一步阐明TLR也在其中扮演重要角色。

由于肿瘤在发生发展过程中可以产生一些能被TLR识别的内源性配体，所以TLR在肿瘤免疫监视中可能发挥了一定作用。

Toll样受体（Toll-likereceptors，TLRs）家族是一种具有固有免疫作用，并在低度慢性炎症中扮演着重要角色的一种传递炎症信号的门户蛋白。

目前认为他与胰岛素抵抗的形成及2型糖尿病的发生、发展有着密切的联系。

它不但能够识别病原相关分子模式，而且与机体的抗感染免疫反应也有十分密切的关系。

Toll样受体能够结合其相对应的配体，继而可以产生信号转导，启动其参与的多个炎症反应相关的基因转录，从而释放炎症因子，参与炎症反应，在低度炎症及免疫反应中发挥着其重要作用。

目前认为TLR4及TLR2是在其家族中占有重要地位，在固有免疫及炎症免疫中扮演着重要的角色，目前已证实分布在脂肪组织、肌肉、肝脏等组织中的Toll受体4参与胰岛素的抵抗。

目前认为Toll受体4主要是通过炎症反应参与其中的。

目前研究显示我们人体内存在着大量的Toll受体的配体，他主要包括内源性及外源性两种。

有学者认为脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是Toll受体的外源性配体的典型代表。

Toll受体的内源性配体主要包括游离脂肪酸（freefattyacid，FFA）、热休克蛋白、黏多糖降解产物、高糖、血管外的纤维素等。

目前认为即使没有以脂多糖代表的外源性配体，这些内源性配体也能够激活TLR4介导的炎症反应通路。

进而产生低度炎症反应及固有免疫反应。

TLRs下游十分重要的信号分子是有一种叫做NF-kB的转录因子，在免疫炎症基因调节中起着很重要的作用，同时对炎症因子的分泌也起着关键的调节作用。

（这句话是什么意思）目前有学者认为：

TLR4/NF-κB信号通路可能受连接天然免疫、脂肪代谢、胰岛素抵抗以及血管炎症和动脉硬化的一个枢纽。

当然TLR4/NF-κB信号通路不是唯一的炎症过程，人体内还有一些其他的炎症信号通路参与，c-Jun氨基末端激酶信号通路和p38MAPK信号通路也参与了炎症反应，但是TLR4/NF-κB信号通路是被认为最重要的炎症反应通路。

有很多研究[10]，都提示他与胰岛素级糖尿病的形成是有很重要的关系的。

我们知道2型糖尿病是一种多基因控制的疾病，TLR4/NF-κB等介导固有免疫反应的信号通路的基因突变可能与2型糖尿病的危险因素的代谢表型有关，可能参与2型糖尿病的形成。

目前在哺乳动物中已经发现的TLR有13种。

TLR4是最早发现也是研究最深入的TLR,主要分布在单核细胞、巨噬细胞、NK细胞和脂肪细胞的胞膜上,与配体结合后可通过NF-kB信号途径生成并释放大量的促炎细胞因子。

Toll样受体胞膜外区主要行使识别受体及与其他辅助受体（co-receptor）结合形成受体复合物的功能。

Toll样受体的胞浆区与IL-1R家族成员胞浆区高度同源（IL-1R介导的信号传导系统和机制与果蝇类似），该区称为Toll-IL-1受体结构域（Toll-IL-1receptordomain，TIR结构域）。

TIR具有嗜同性相互作用（homophilicinteraction），藉此来募集下游含有TIR的信号分子，组成信号复合体。

但是二者胞外部分不相关，TLR胞膜外区为有17个～31个亮氨酸富集的重复序列（Leucinerichrepeats，LRRs），并且都含有3个胞外段辅助蛋白即MD-1、MD-2和RP105，参与对疾病相关分子模式（PAMP）的识别；而IL-1R为Ig样的结构，在哺乳动物中，一些胞浆蛋白也存在TIR域，如2种信号接受蛋白，MyD88和TIR域的接受子蛋白（TIRdomain-containingadaptorprotein，TIRAP），二者在TIR信号传导中起作用。

引至何处

Toll样受体-4（Tolllikereceptor4，TLR4）作为保守的模式识别受体，在机体的免疫调控中有着重要作用。

脑室注入饱和脂肪酸可以显著增加下丘脑TLR4和相关炎性基因的表达，TLR4抗体干预可逆转高脂饮食诱导的下丘脑炎性反应和胰岛素抵抗并降低食物的摄入量。

核因子-κB（Nuclearfactor-κB,NF-κB）作为TLR4的下游信号分子，在机体的炎性反应中起着关键的作用。

最新研究发现NF-κB与下丘脑的胰岛素和瘦素抵抗也密切相关。

利用外源性载体激活下丘脑的NF-κB可以引起下丘脑的胰岛素和瘦素敏感性降低，导致小鼠的摄食增加，而同样的方法抑制下丘脑NF-κB的活性后可使肥胖小鼠的摄食量降低，体重减轻。

以上研究提示高脂饮食诱导的下丘脑炎性反应在机体的摄食紊乱和肥胖的发生中起着重要的作用。

同样高脂饮食条件下，肥胖抵抗大鼠是否可以通过抑制下丘脑的炎性反应从而阻止肥胖的发生，目前还没有相关的报道。

近年来研究表明食物中的饱和脂肪酸可通过与TLR4结合激活相关信号通路,若缺失TLR4基因,可缓解高脂饮食诱导的小鼠肥胖和胰岛素抵抗的发生。

但TLR4基因缺失的小鼠其内脏脂肪组织中免疫细胞及脂肪因子如何改变少见报道,本研究探讨TLR4基因敲除对小鼠附睾脂肪组织中免疫细胞及脂肪因子的影响。

脂肪组织在肥胖个体伴随的炎性反应有着极其重要的作用，脂肪细胞与免疫细胞相互作用促进炎性因子分泌的增加，进一步研究发现脂肪组织中的巨噬细胞是炎性因子分泌的主要来源，伴随着巨噬细胞浸润的增加，炎性因子分泌增加。

在介导巨噬细胞迁移和聚集的因素中，骨桥蛋白（osteopontin，OPN）因其较强的粘附趋化能力及在细胞迁移过程中的重要作用而备受关注。

另一项研究发现，高脂饮食条件下，OPN-/-小鼠与野生型小鼠相比体重无显著变化，但是胰岛素敏感性却显著增加，静脉注入OPN抗体可以明显改善饮食诱导肥胖小鼠的胰岛素敏感性。

上述研究案例暗示我们：

OPN介导的脂肪组织炎性反应在高脂饮食诱导的胰岛素抵抗的发生中起着重要的作用。

但OPN介导的脂肪组织炎性反应是否参与了脂肪酸类型不同高脂饮食诱导的肥胖大鼠的胰岛素敏感性差异，目前尚不清楚。

这个是结论吗？

和我的论文结论是不是冲突了

1实验材料

1.1实验对象

C57BL/6小鼠:

SPF级，36只，雄性，出生第21d（3周龄），体重量（12.5±0.5g），TLR4-/-小鼠由北京协和医学院韩代书教授馈赠;小鼠常规饲养,保持室内温度在22益~26益,湿度40%~60%,随意自由饮水和给予标准饲料进食。

实验过程中对动物的饲养及取材均遵守实验动物管理及保护的相关规定。

1.2实验仪器

Fresco21型低温高速离心机Thermo美国

702型-80℃超低温冰箱Thermo美国

微量可调移液器Gilson法国

倍易型血糖仪强生中国

XB70型制冰机GRANT中国

SW-CJ-lf型超净工作台苏州净化设备公司中国

TGL-16B型高速台式离心机上海飞鸽中国

XH-C型旋涡混匀器江苏金怡中国

HDB-PLUs型恒温金属浴HEROS中国

DYY-7C型水平电泳仪北京六一中国

75S/00771型凝胶成像系统BIO-RAD美国

YP402N型电子称上海精科中国

PHS-3C型台式ph计上海精科中国

NanoDrop2000分光光度计Thermo美国

DHG-9240AS型电热鼓风干燥箱上海博迅中国

721型分光光度计上海光学仪器中国

Agilent2100生物分析仪安捷伦美国

AgilentG2505C扫描仪安捷伦美国

AgilentG2545A杂交炉安捷伦美国

97型PCR仪ABI美国

7600-110全自动生化分析仪日立日本

1.3实验试剂

1.3.1生化指标试剂

①强生血糖试纸：

强生医疗器械有限公司，上海；

②丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定试剂盒：

第一化学药品株式会社，日本；

③血糖（GLU）测定试剂盒：

第一化学药品株式会社，日本；

④甘油三酯（TG）测定试剂盒：

第一化学药品株式会社，日本；

⑤总胆固醇（TC）测定试剂盒：

第一化学药品株式会社，日本；

⑥低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）测定试剂盒：

第一化学药品株式会社，日本；

⑦高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）测定试剂盒：

第一化学药品株式会社，日本；

1.3.2Westernblot主要试剂

三羟甲基氨基甲烷（Tris）美国sigma公司

丙烯酰胺美国sigma公司

十二烷基硫酸钠（SDS）美国sigma公司

过硫氨酸（APS）美国sigma公司

溴酚兰美国sigma公司

四甲基乙二胺（TEMED）美国sigma公司

β-巯基乙醇美国sigma公司

Tween-20美国Amresco公司

甘氨酸美国Amresco公司

亚甲叉双丙烯酰胺美国Amresco公司

BCA蛋白检测试剂盒（cat#PQ0011）浙江联科生物技术有限公司

小鼠抗小鼠TLR4抗体（cat#76B357.1）英国abcam公司

小鼠抗小鼠β-actin抗体（cat#BM062）武汉博士德生物技术有限公司

山羊抗小鼠IgG（H+L），HRP试剂盒（cat#CW0102）美国Rockland

浓盐酸天津化学试剂三厂丙三醇（甘油）天津化学试剂三厂

甲醇天津化学试剂三厂

小鼠淋巴细胞分离液（cat#DKW33-R0100）深圳达科为生物技术有限公司

总蛋白提取试剂盒（cat#P1250）北京普利莱公司

PotentECL高敏化学发光试剂盒（cat#P142S）浙江联科生物技术有限公司

1.3.3其他试剂

①TAK-242，购于上海皓元生物科技有限公司（cat#HY-11109）

②琼脂糖，购于美国MedchemExpress；

③冰乙酸、无水乙醇、硼酸、EDTA等试剂为分析纯试剂，购于上海生物工程公司和北京鼎国公司

④mirVanaTMRNAIsolationKit（AppliedBiosystemp/nAM1556）,总RNA提取试剂

1.4主要试剂调配

1.4.11MTris-Hcl（pH6.8）

称取Tris60.57g，加双蒸水430ml，充分搅拌溶解，用浓盐酸（原液）滴定至pH6.8，再加入双蒸水定容至500ml。

1.4.21MTris-Hcl（pH.8）

称取Tris60.57g，加双蒸水430ml，充分搅拌溶解，用浓盐酸（原液）滴定至pH8.8，再加入双蒸水定容至500ml。

1.4.310％APS

称取l.0gAPS溶于10ml双蒸水中，混匀，4℃避光保存。

1.4.430％丙烯酰胺称取

1.0g亚甲叉双丙烯酰胺和29.0g丙烯酰胺溶于双蒸水中，总体积为60ml，再加热至37℃溶解，最后加双蒸水定容至100ml，避光4℃保存。

1.4.510％SDS

称取10.0mgSDS溶于90ml双蒸水中，再加热到68℃充分溶解，加双蒸水定容至100ml，放于4℃保存。

1.4.68％分离胶1MTris-Hcl（pH=8.8）2.5ml30％丙烯酰胺2.7m1双蒸水

1.4.6ml10％SDS

100μl10％APS100μlTEMED6μl

1.4.712％分离胶

1MTris-Hcl（pH=8.8）2.5ml30％丙烯酰胺1.4.0m1双蒸水3.3ml10％SDS100μl10％APS100μlTEMED4μl

1.4.85％浓缩胶

1MTris-Hcl（pH=6.8）0.375ml30％丙烯酰胺0.5ml双蒸水2.06ml10％SDS30μl10％APS30μlTEMED3μl

1.4.9TPBS缓冲液

0.01MPBS250mlTween-20250μl充分混匀

1.4.10电泳工作液

电泳储存液95ml10％SDS5m1加双蒸水定容至500ml

1.4.11电泳储存液

甘氨酸47.0gTris7.55g加双蒸水定容至500ml

1.4.12转膜缓冲储备液

甘氨酸11.4.5gSDS1.85gTris29.0g加双蒸水定容至500ml1.4.13转膜缓冲液工作液转膜缓冲液储存液100ml甲醇200ml加双蒸水定容至1000ml1.4.14封闭液伊利脱脂奶粉2.0g0.01MPBS40ml

1.4.15Loadingbuffer1MTris-Hcl（pH=6.8）

2.5ml溴酚蓝50.0mgSDS1.0g甘油5.0ml加双蒸水定容至10ml溶解，放于室温保存，使用前加入β-巯基乙醇（1:

20）。

1.4.16DEPC水：

取双蒸水1000ml，15磅高压灭菌15min，加入DEPC1ml，充分混匀并4℃过夜，于15磅高压灭菌15min，备用。

1.4.17TAK-242贮存液：

准确称取5.0mgTAK-242，用2.5mlDMSO溶解，完全溶解后，分装在EP管中，每管50μl及10μl（10μl的50μl管即可），储存液每μl含2μgTAK-242（2μg/μl），无菌分装，储存于-80℃。

1.4.18TAK-242应用液：

取储存液，短暂离心，根据需要量，用无菌生理盐水做适当稀释。

2实验方法

2.1动物培养与分组

大鼠适应性饲养1周后，按体重随机分为2组，正常对照组（10只），喂以基础饲料,高脂饲料组（45只），喂养猪油为主要脂肪成分配制的高脂饲料；各组大鼠均单笼饲养，自由摄食和饮水，动物房温度（20±2）℃，相对湿度（50±10）%，明暗周期12比12。

第10周时，高脂实验组大鼠体重基本稳定，参照对照组大鼠的平均体重及标准差，将高脂饲料组大鼠分为DIO大鼠（体重大于对照组平均体重加1.96倍标准差）和DIO-R大鼠（体重小于对照组平均体重加1倍标准差），体重介于二者之间的大鼠不纳入本次研究。

饲养条件：

小鼠于空调温控动物室饲养，温度20～24℃，相对湿度50%～60%，照明度为280～350LX，光照节律为明/暗12h交替，小鼠自由摄食、饮水。

1.2

饲料：

①基础饲料：

由河北北方学院动物室提供，配方为：

普通面粉20%、玉米面粉40%、豆粉20%、大麦麸皮6%、骨粉5%、鱼粉8%、鱼肝油1%。

②高脂饲料：

由河北北方学院动物室制作，配方为：

基础饲料53%、猪油10%、奶粉5%、鸡蛋11%、白糖5%、黄豆16%。

2.1.1动物分组

45只刚断乳（出生21d）的雄性C57BL/6小鼠，体重12.5±0.5g，以基础饲料适应性饲养3天。

第4天（出生25d），随机抽取17只小鼠作为正常对照组，以普通基础饲料喂养（lowfatdiet,LFD）；其余28只作为高脂实验组，给予高脂饲料喂养（highfatdiet,HFD）。

2.1.2建立胰岛素抵抗小鼠模型

小鼠饲养期间，每日称量记录饲料余量，了解小鼠进食状况；每周称量小鼠体重一次，以记录生长曲线。

当高脂饲料饲养组小鼠与基础饲料饲养组小鼠的体重有显著差异时，行葡萄糖耐量实验（glucosetolerancetest,GTT）和胰岛素耐量实验（insulintolerancetest,ITT），观察小鼠胰岛素抵抗的发生。

2.1.3葡萄糖耐量实验

小鼠禁食12h后，测定小鼠体重，按2.0g葡萄糖／kg体重计算，腹腔注射25%的葡萄糖，应用血糖仪测定注射前和注射后30、60、90、120min的小鼠尾静脉血糖值，观察正常对照组LFD组、高脂饮食组HFD组小鼠在注射葡萄糖前后各时间点血糖浓度的变化。

2.1.4胰岛素耐量实验

小鼠行GTT后，间隔1周，进行ITT实验。

小鼠禁食12h后，测定