水稻种子的miRNA的表征特性和表达谱.docx

1、水稻种子的miRNA的表征特性和表达谱916930核酸研究，2009，卷。 37，第3号 网上发表于2008年12月22日个人主页：10.1093/nar/gkn998水稻种子的miRNA的表征（特性）和表达谱摘要：小RNA（sRNAs）是真核生物中常见的和有效的基因表达的调节物。为了描述水稻种子发育期间sRNAs的表达，（我们）通过大规模的平行测序技术（MPSS），结果获得了797 399 22个核苷酸的序列标签，其中161 111是清楚的。对染色体上的小RNA的分布的分析显示大部分sRNAs来自穿插重复(复制子),这(穿插复制子)主要包括转座子，表明水稻种子sRNAs主要功能是使转座子沉默

2、。通过综合分析，可供选择研究的26个新的miRNA和12个miRNA 被鉴定。通过杂交生成的芯片做探针对已知的和新的 miRNA的表达谱的进一步分析显示大多数miRNA在一个或两个水稻组织优先表达。对miRNA和相应的目标基因的表达的模式的详细比较揭示了这些基因之间的负相关关系，而这些基因中几乎没有呈正相关的。此外，miRNA和相应的miRNA*s的不同的积累表明miRNA*s的功能miRNA的成熟，以及miRNA的调控功能。此外，miRNAs和miRNA*s积累量的不同表明miRNA*s除了是成熟miRNAs的中间体外，还有调节miRNA的功能的作用。引言小RNA分子被普遍认为是真核生物中常

3、见的和有效的基因表达的调节物。根据目前的见解，sRNAs通常被分为几类，包括小分子RNA（miRNAs），小干扰RNA（siRNAs）,反式作用的siRNAs（ta-siRNA; 4），天然反义转录的siRNAs（nat - siRNAs; 5）和后生动物的PIWI -干扰RNA（piRNAs）（6）。在植物中，反式作用的 siRNAs和天然反义转录的siRNAs指导目标mRNAs的切割，而异染色质中的siRNAs则参与DNA和组蛋白修饰，导致基因转录的沉默(7)。除了，天然反义转录的siRNAs（nat - siRNAs; ）,大米中的天然反义miRNA（nat- miRNAs）最近被识别(

4、鉴定)（8）。miRNA的（21nt）是由不完全互补的非编码序列产生，是茎环RNA的前体。该miRNA的基因可以通过RNA聚合酶II（9）被转录，形成原始的miRNA（pri- miRNAs）。在较高的植物中，pri- miRNAs 被Dicer酶样1（DCL1;10）或DCL4（11）通过分裂加倍加工以形成双链miRNA，然后是双链的miRNA 在第30个碱基末端 被 Hua Enhancer1（HEN1）甲基化（12）并被载入Argonaute 1（AGO1）上,在Argonaute 1（AGO1）上成熟的miRNAs指导目标mRNAs的切割。与此同时，转运者（称为miRNA*s）渐渐的被

5、降解（13）。虽然第一个miRNA（line-4）在线虫中（14）通过正向遗传学筛选被发现，但是目前已知植物的大多数miRNA已通过按大小选定的克隆和测序被鉴定，尤其是在拟南芥（15-18）和水稻（19-21）中。最近,高通量测序技术的发展已经加快了了sRNA克隆报道所覆盖的深度。在拟南芥中，通过大规模的平行测序（MPSS）的分析分别从花序和幼苗中鉴定了67 528和27 833个独特的17 -核苷酸序（22）。在拟南芥幼苗，莲座丛叶，花，角果中通过以焦磷酸测序为基础的高通量平行测序技术测序了超过340万个独特sRNAs（11），并有48个新的miRNA用类似的方法得到鉴定（23）。在水稻约2

6、0个 miRNAs通过对穗数，幼苗和茎序的大规模平行测序技术进行sRNAs的鉴定 (识别)（8,24-26）。对miRNA的理解已经提出了几个要求（27）。 miRNA的前体应包含稳定和保守的茎环结构，这个茎环结构可以被Mfold预测（28），并且成熟的miRNA的应该能通过Northern杂交或测序而被发现。此外，由于miRNA的基因通过RNA聚合酶II被转录，加帽和磷酸化成为正常的mRNAs（9），因此EST分析是鉴定新的miRNA的一个强有力的方式（29）。miRNA的序列的鉴定，一个由Dicer酶切割的与miRNA对应的产品（11），也强烈表明，相应的sRNA分子确实是由Dicer酶R

7、NA酶III加工的（11,23,30）。水稻是人类日常生活重要的食物资源并作为单子叶植物的模式物种。水稻种子的发育和成熟，一个高度专业化养分贮存器官和生殖发育，涉及细致的规定和优良基因在转录和转录后水平（31）。为了进一步研究了水稻种子发育复杂的调控网络，并阐明sRNAs在此过程中的职能，我们利用MPSS和综合生物信息学进行分析，结果鉴定出新的和可能的 miRNA。此外，miRNA的表达谱通过miRNA的芯片杂交被分析，miRNA的芯片杂交已被广泛用于研究几个物种中miRNA的表达水平（32-35）。表达方式的比较揭示了miRNAs和相应的靶基因之间的正负相关性 ，这种相关性大大扩展了我们对m

8、iRNA如何参与到水稻种子的发育中的理解。材料与方法cDNA文库构建与MPSS分析通过收集开花后3，6，9和12天（DAA）的大米（水稻，粳稻中华11品种）不成熟的种子中RNA，并且用Trizol试剂(Invitrogene, Nottingham, UK)将总RNA分别萃取出来，然后将Trizol试剂与等量的单独的样本混合.经过在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上分离后，对小RNA（sRNAs）18-26序列的片段通过sRNAs凝胶萃取试剂盒（Takara生物，大津，日本）而被观察。该cDNA文库的构建和MPSS分析由前面所述的Takara生物公司（大津，日本）所实施.为（36）。简而言之，R

9、NAs20 多 序列片段被去磷酸化，并与RNA - DNA的嵌合3转接子绑结在一起。经变性的PAGE纯化后，与转接子连接的RNA片段被磷酸化并与RNA - DNA的嵌合5转接子绑结 。由此产生的产物被逆转录并与引物结合通过PCR技术扩增与。然后扩增产物被SfaNI进行酶切 并克隆到标签载体pMBS（Solexa）上。由此合成的拥有总数超过130复杂性文库被扩增并负载在微生物体内。最后，超过100万微生物被装到每个flowcell,22个碱基的标签序列由一系列酶反应被确定。转接子序列的标记被掩盖。清除对应的核糖体RNA（rRNAs），转移RNA（tRNAs），小核RNA（snRNAs）和小型（s

10、noRNAs），核仁RNA的标记(分析),总的标记(分析)量大约为250 000 。sRNAs正常化，如前面描述的以每400万为单位来转录（TPQ）（22,36）。这些标记和水稻种子库中大量的sRNAs可以在国家生物技术信息中心，基因综合表达序列号GSE11974中找到。数据集水稻基因组序列和注释（版本5.0）以及玉米组合序列（AZM5）从TIGR中获得（基因组研究学会）。rRNAs，tRNAs，snRNAs和snoRNAs的序列从数据库中被下载，这个数据库包括欧洲核糖体RNA数据库，tRNA的基因组数据库和未编码的数据库。成熟的miRNAs与annoated茎环序列从miRBase中获得。水

11、稻,拟南芥和线虫sRNAs序列，分别从水稻的MPSS数据库,拟南芥小RNA的项目GenBank资料库中下载。sRNA群落和聚集点的鉴定sRNAs聚合成群落取决于他们在前面所述的基因组上的位置，即在500 碱基对以内的彼此聚集成一个群落（22）。要确定sRNA的聚集区，每一个标签(标记)的丰富度首先要通过在基因组上的标记的重复次数而被正常化，然后对所有没有在500 bp内的标记量进行了计算。一流的窗口被用作在两个方向延伸，直至一个窗口遇到未标记的（11）。miRNA和相应的目标mRNA的预测 所有已知的水稻的miRNA，其前体不包含重复序列，基因组匹配 180 TPQ）被确定为miRNAs（os

12、a- miR827b和osa- miR1859），其中osa- miR827b与拟南芥athmiR827直接同源。通过表达序列标签与候选前体的比较表明5个以前未确实的非编码RNA 确实是miRNA。六个前体，与表达序列标签相匹配并且以前被视为保守假设蛋白，被确定为候选的miRNA（osa- miRc1 - c6）。此外，6个候选miRNA的量大于 15 TPQ已经被确定。做为一个整体。，26个新的（表2）和12个候选德miRNA（表的S12）在本研究都被鉴定（预测的结构如补充数据集1所示）。 在新发现的miRNAs中，osa-miR396f是osa-miR396家族的一个同源体，是两个新的mi

13、RNAs的其中的一个，在其他物种中有直系同源。正如在图2c所示，miR396基因按照成熟miRNA的序列可分为两个亚组。这两个在玉米中新的未确认的miRNA，zmamiR396c来自于AZM5_13 014而zma - miR396d来自于AZM5_11 578，osa-miR396d-e比osa-miR396a-c更为保守。 osa-miR827b在水稻和拟南芥中都是保守的。在miRBase（V11.0），osa-miR827，最近通过相似性分析鉴定了miR827（52），但是，在成熟的miRNA没有sRNA或miRNA_s位点在osa- miR827的前体出现在种子库或其他公共库里。相反，在osa-miR827b位点的成熟的miRNA在