水稻种子的miRNA的表征特性和表达谱.docx

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水稻种子的miRNA的表征特性和表达谱

916–930核酸研究，2009，卷。

37，第3号网上发表于2008年12月22日

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10.1093/nar/gkn998

水稻种子的miRNA的表征（特性）和表达谱

摘要：

小RNA（sRNAs）是真核生物中常见的和有效的基因表达的调节物。

为了描述水稻种子发育期间sRNAs的表达，（我们）通过大规模的平行测序技术（MPSS），结果获得了79739922个核苷酸的序列标签，其中161111是清楚的。

对染色体上的小RNA的分布的分析显示大部分sRNAs来自穿插重复（复制子）,这（穿插复制子）主要包括转座子，表明水稻种子sRNAs主要功能是使转座子沉默。

通过综合分析，可供选择研究的26个新的miRNA和12个miRNA被鉴定。

通过杂交生成的芯片做探针对已知的和新的miRNA的表达谱的进一步分析显示大多数miRNA在一个或两个水稻组织优先表达。

对miRNA和相应的目标基因的表达的模式的详细比较揭示了这些基因之间的负相关关系，而这些基因中几乎没有呈正相关的。

此外，miRNA和相应的miRNA*s的不同的积累表明miRNA*s的功能miRNA的成熟，以及miRNA的调控功能。

此外，miRNAs和miRNA*s积累量的不同表明miRNA*s除了是成熟miRNAs的中间体外，还有调节miRNA的功能的作用。

引言

小RNA分子被普遍认为是真核生物中常见的和有效的基因表达的调节物。

根据目前的见解，sRNAs通常被分为几类，包括小分子RNA（miRNAs），小干扰RNA（siRNAs）,反式作用的siRNAs（ta-siRNA;4），天然反义转录的siRNAs（nat-siRNAs;5）和后生动物的PIWI-干扰RNA（piRNAs）（6）。

在植物中，反式作用的siRNAs和天然反义转录的siRNAs指导目标mRNAs的切割，而异染色质中的siRNAs则参与DNA和组蛋白修饰，导致基因转录的沉默（7）。

除了，天然反义转录的siRNAs（nat-siRNAs;）,大米中的天然反义miRNA（nat-miRNAs）最近被识别（鉴定）（8）。

miRNA的（~21nt）是由不完全互补的非编码序列产生，是茎环RNA的前体。

该miRNA的基因可以通过RNA聚合酶II（9）被转录，形成原始的miRNA（pri-miRNAs）。

在较高的植物中，pri-miRNAs被Dicer酶样1（DCL1;10）或DCL4（11）通过分裂加倍加工以形成双链miRNA，然后是双链的miRNA在第30个碱基末端被HuaEnhancer1（HEN1）甲基化（12）并被载入Argonaute1（AGO1）上,在Argonaute1（AGO1）上成熟的miRNAs指导目标mRNAs的切割。

与此同时，转运者（称为miRNA*s）渐渐的被降解（13）。

虽然第一个miRNA（line-4）在线虫中（14）通过正向遗传学筛选被发现，但是目前已知植物的大多数miRNA已通过按大小选定的克隆和测序被鉴定，尤其是在拟南芥（15-18）和水稻（19-21）中。

最近,高通量测序技术的发展已经加快了了sRNA克隆报道所覆盖的深度。

在拟南芥中，通过大规模的平行测序（MPSS）的分析分别从花序和幼苗中鉴定了67528和27833个独特的17-核苷酸序（22）。

在拟南芥幼苗，莲座丛叶，花，角果中通过以焦磷酸测序为基础的高通量平行测序技术测序了超过340万个独特sRNAs（11），并有48个新的miRNA用类似的方法得到鉴定（23）。

在水稻约20个miRNAs通过对穗数，幼苗和茎序的大规模平行测序技术进行sRNAs的鉴定（识别）（8,24-26）。

对miRNA的理解已经提出了几个要求（27）。

miRNA的前体应包含稳定和保守的茎环结构，这个茎环结构可以被Mfold预测（28），并且成熟的miRNA的应该能通过Northern杂交或测序而被发现。

此外，由于miRNA的基因通过RNA聚合酶II被转录，加帽和磷酸化成为正常的mRNAs（9），因此EST分析是鉴定新的miRNA的一个强有力的方式（29）。

miRNA的序列的鉴定，一个由Dicer酶切割的与miRNA对应的产品（11），也强烈表明，相应的sRNA分子确实是由Dicer酶RNA酶III加工的（11,23,30）。

水稻是人类日常生活重要的食物资源并作为单子叶植物的模式物种。

水稻种子的发育和成熟，一个高度专业化养分贮存器官和生殖发育，涉及细致的规定和优良基因在转录和转录后水平（31）。

为了进一步研究了水稻种子发育复杂的调控网络，并阐明sRNAs在此过程中的职能，我们利用MPSS和综合生物信息学进行分析，结果鉴定出新的和可能的miRNA。

此外，miRNA的表达谱通过miRNA的芯片杂交被分析，miRNA的芯片杂交已被广泛用于研究几个物种中miRNA的表达水平（32-35）。

表达方式的比较揭示了miRNAs和相应的靶基因之间的正负相关性，这种相关性大大扩展了我们对miRNA如何参与到水稻种子的发育中的理解。

材料与方法

cDNA文库构建与MPSS分析

通过收集开花后3，6，9和12天（DAA）的大米（水稻，粳稻中华11品种）不成熟的种子中RNA，并且用Trizol试剂（Invitrogene,Nottingham,UK）将总RNA分别萃取出来，然后将Trizol试剂与等量的单独的样本混合.经过在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上分离后，对小RNA（sRNAs）18-26序列的片段通过sRNAs凝胶萃取试剂盒（Takara生物，大津，日本）而被观察。

该cDNA文库的构建和MPSS分析由前面所述的Takara生物公司（大津，日本）所实施.为（36）。

简而言之，RNAs20多序列片段被去磷酸化，并与RNA-DNA的嵌合3’转接子绑结在一起。

经变性的PAGE纯化后，与转接子连接的RNA片段被磷酸化并与RNA-DNA的嵌合5’转接子绑结。

由此产生的产物被逆转录并与引物结合通过PCR技术扩增与。

然后扩增产物被SfaNI进行酶切并克隆到标签载体pMBS（Solexa）上。

由此合成的拥有总数超过130复杂性文库被扩增并负载在微生物体内。

最后，超过100万微生物被装到每个flowcell,22个碱基的标签序列由一系列酶反应被确定。

转接子序列的标记被掩盖。

清除对应的核糖体RNA（rRNAs），转移RNA（tRNAs），小核RNA（snRNAs）和小型（snoRNAs），核仁RNA的标记（分析）,总的标记（分析）量大约为250000。

sRNAs正常化，如前面描述的以每400万为单位来转录（TPQ）（22,36）。

这些标记和水稻种子库中大量的sRNAs可以在国家生物技术信息中心，基因综合表达序列号GSE11974中找到。

数据集

水稻基因组序列和注释（版本5.0）以及玉米组合序列（AZM5）从TIGR中获得（基因组研究学会）。

rRNAs，tRNAs，snRNAs和snoRNAs的序列从数据库中被下载，这个数据库包括欧洲核糖体RNA数据库，tRNA的基因组数据库和未编码的数据库。

成熟的miRNAs与annoated茎环序列从miRBase中获得。

水稻,拟南芥和线虫sRNAs序列，分别从水稻的MPSS数据库,拟南芥小RNA的项目GenBank资料库中下载。

sRNA群落和聚集点的鉴定

sRNAs聚合成群落取决于他们在前面所述的基因组上的位置，即在500碱基对以内的彼此聚集成一个群落（22）。

要确定sRNA的聚集区，每一个标签（标记）的丰富度首先要通过在基因组上的标记的重复次数而被正常化，然后对所有没有在500–bp内的标记量进行了计算。

一流的窗口被用作在两个方向延伸，直至一个窗口遇到未标记的（11）。

miRNA和相应的目标mRNA的预测

所有已知的水稻的miRNA，其前体不包含重复序列，基因组匹配<30倍。

我们对匹配超过30倍基因组的标记序列的分析表明其中72.9％的序列（4760个中有3470个）源于重复序列。

因而匹配超过30倍的基因组的标记在miRNA的预测期间被筛选出,并且相应的rRNA，tRNA和snRNAs和snoRNAs被淘汰。

在标记的左右两侧400bp的基因组序列被提取并且沿提取的序列有一个450bp的滑动窗口。

所有的片段序列包含每一个标记都在MFOLD3.2的帮助下折叠（28）。

最低能量的序列结构通过一种Perl脚本语言被进一步的分析来核对这些结构是否符合已知植物中大多数miRNA标准。

候选前体的序列使用RepeatMasker（http:

//www.repeatmasker.org）进行了分析来消除重复序列。

最后，通过硅片检验来预测其二级结构的标记通过基因组的位置被聚集在一起。

有miRNA*和/或EST支持证据的候选者确定为miRNAs。

为了预测miRNA的靶位点，FASTA项目被用来研究水稻cDNA数据库。

每个miRNA的被用来计算错配数与。

简言之，假设miRNA靶基因与其完全互补配对的序列的最小自由能（GMFE）和每一个实际的miRNA预测的自由能分别被测定。

最小自由能（MFE）的比率计算为Gtarget/GMFE（4）。

错配数的必须小于4并且最小自由能比率必须小于0.73，以及所有miRNA的匹配和预期的靶基因被人工核对。

所有用于miRNA和靶基因的预测的Perl脚本在需要时是可利用的。

miRNA芯片的产生和杂交

miRBasevesion8.0中的miRNA，在此研究中最新鉴定的miRNA及其他的候选者被收集用来设计探针。

独立序列（polyT18或polyT19）连接到miRNA的探针的3’端，最后获得40个核苷酸探针，使他们在芯片表面有相应的扩展空间。

然后该探针通过用C65’-氨基改性剂连接到激活滑动面（35）。

tRNA和U6RNA的探针被设计用来作为内部阳性对照使用。

在此外，与任何sRNAs无同源性的8个DNA序列被设计并用来作为外部阳性对照。

所有探针在MWG公司合成并研配的DNA溶液（40mmol/L），这些探针在幻灯片中三个重复的点上被发现。

sRNAs的标记和芯片杂交技术的形成如前所述（35）。

具体而言，从不同样本中提取的总的sRNAs中50到100毫克使用Ambion公司的miRNA分离试剂盒将其按大小分离并用T4聚合酶标记（32）。

RNA溶解于包含15％甲酰胺，0.2％的SDS，3倍的SSC和50倍的Denhardt’s的杂交缓冲液中。

经过42摄氏度一夜的杂交后，游离的片断先在0.2％的SDS和2倍的SSC中经过四分钟反应,然后再0.2倍的SSC中反应四分钟而被洗掉。

杂交片段用CapitalBio®LuxScanTM10K/A可看见，并可以用GenePixPro4.0进行分析.作为探针的最大信号水平为200,800被设置为发现miRNA的信号阈值。

杂交信号正常化采用介质中心法。

对于每一个组织（胚胎组织除外）,两个片段进行杂交,那么一个组织中的每个miRNA最终会获得六种杂交信号（胚胎中3个信号）。

由于不成熟胚胎组织很难收集并且考虑到芯片上的探针有3个重复点，因此只出现一种杂交。

最后杂交信号的数目可利用TIGRMev进行计算和观察。

通过微阵列杂交进行基因表达分析

水稻基因组排列的基因芯片被用于DNA微阵列分析。

RNA的样本为miRNA微阵列杂交中的芯片相同。

每个样本有两个生物学上的重复，并且在每个杂交中用10毫克的cRNA。

洗涤，染色与芯片的扫描，根据提供的草案完成。

杂交信号通过使用Affymetrix芯片套装方案正常化（版本5.0）并且利用TIGR的测量使其可视化。

Affymetrix芯片公的微阵列数据是根据NCBI中的系列数GSE11966,每个组织用最小二乘法进行线性回归来检查芯片的复制质量，（40）（表中一）。

通过实时定量RT-PCR方法（定量PCR）完成成熟miRNA的表达分析

总RNA从各种不同的组织中被分离（同在miRNA的基因芯片杂交所用的相同），用无RNA酶的DNA酶I进行处理，然后将20毫升的反应混合物在37摄氏度下用聚合酶

（一）处理1小时使其腺苷酸聚合。

经过酚氯仿抽提和乙醇沉淀后，RNA被解散，用聚（T）的转接器逆转录（41）。

定量PCR是利用绿色荧光SYBR实时PCR组合进行的，所有所用的引物在表S2中列出。

阈值周期通过软件转子基因6被计算出来。

CT值利用标准曲线被转换成相对的拷贝数（42）。

作为参考（参照）基因，5.8SrRNA基因被用于定量PCR检测拟南芥中的miRNA（41）。

要检查水稻基因中5.8SrRNA长度是否合适，我们首先调查5.8SrRNA的表达水平和水稻基因组基因芯片阵列中其他一些建议参考基因（43），结果表明，这些基因的表达水平是相对稳定的（补充图1A）。

而且，5.8SrRNA基因表达水平通过使用作为参考基因的水稻肌动蛋白基因定量PCR被刻画（43），结果证实了研究中使用的样本中的5.8SrRNA的稳定表达（补充图1B）。

这些表明，对于正常的定量PCR数据利用水稻5.8SrRNA基因是适合。

此外，对单个miRNA定量PCR分析（检测）的反应效率转子基因6软件决定。

测试的miRNA（或指导基因）纯化产品的10倍稀释系列在被用来作为定量PCR的模板来生成一个与测试的miRNA（或指导基因）相对应的CT值的拷贝数（41）。

斜率是指-（1/log（E+1），其中E是反应效率。

在转子基因6软件，反应效率的最优值是1，定义为放大价值-1。

结果表明，测试miRNA的反应效率接近最佳值（补充图2）。

序列比对和系统发育分析

miR169和miR396家族的前体的序列通过Clustalw被排列（http:

//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2;44）,保守片段在GeneDoc方案的帮助下而可视化。

要构建AGO蛋白的系统发育树，该蛋白序列也是使用Clustalw被排列（44），MEGA4（45）采用邻接法（46）和泊松校正法（47）被用来生成系统发生树（演化树）。

引导试验重复进行了1000次。

结果

水稻种子里的sRNAs符合基因组类的特点

提取不同发育阶段的水稻种子里的RNA都是先断裂为短的RNAs，然后将其用于构建（基因）库。

随后应用大规模并行测序技术（MPSS）剔除不好的（基因）以后获得79739922个碱基的序列（“检测”），并且其中111161个是很清楚的（图1A）。

分析表明，70.5％有特征显著与水稻基因组是一样的（基因组研究协会，TIGR，版本5.0），占总序列的93.8％（表s3）。

现在只有一小部分的序列（2.3％）与叶绿体或线粒体的基因组相匹配（表中三）。

大约9.7％的可认定的序列与非编码RNA（ncRNAs）一致，包括核糖体rRNA，tRNA基因，snoRNAs和snRNAs，这（见表1）占总共序列的61.5％，这和先前在水稻中报道的一致。

所有的与基因组相匹配的序列不包括ncRNAs，由于当时认为（它是）是sRNAs还待进一步分析。

 水稻种子，序列匹配的前体miRNA的占与基因组相匹配的序列的比例少于1.5％，远远低于水稻花，苗，茎（24），以及拟南芥花和苗（22）。

这可能是因为水稻的基因组包含了许多分散的和反向重复序列，它们导致（24）出现大量的siRNAs。

此外，sRNAs中有15.6％明确是编码蛋白质的有义/或反义序列（见表1）并且相应编码的蛋白质参与各种分子功能，生物过程和细胞成分（组成），显示了sRNAs的复杂来源（表s4）。

此外，70.7的与基因组相匹配的sRNA的基因在基因组只出现一次。

这个位点的数目占总共的4.5%），而大约3％的sRNAs与因组相匹配比这高100倍以上。

（表s5）。

对sRNAs分布特性，蛋白质的编码基因和染色体上的重复序列基因表明有一些位点有较高的产生sRNAs的倾向，并且这些sRNAs的产生在其他地区优先，除了着丝粒（图1B，补充图3）。

水稻种子大多的sRNAs起源于转座子

总数为81530的sRNA家族被确认取决于每两个序列之间的距离，而其中的72173个包含分散的重复序列（由RepeatMasker注明，http:

//www.repeatmasker.org;表s6），2967被认为是重复序列（通过重复寻找器;48），表明重复相关的siRNA（rasiRNAs）占用了大部分的sRNAs。

在种子非常丰富rasiRNAs的存在和在种子发育过程中调节转座子活动的作用是一致的。

根据sRNAs丰富度进一步确认排名前50位的热点位点，表明串联重复位点更倾向于产生大量的sRNAs。

排名前50位的19个包含串联重复的热点位点，而只有占总sRNAs家族3.6％的总新社集群串联重复。

这证实了了由串联重复产生的sRNAs机制，Martienssen提出的（49）。

此外，一些mRNAs包括osa-MIR168a,osa-MIR172b,和osa-MIR159a也在发现miRNA的（表七）sRNAs热点高丰度。

用sRNA的标签确认miRNA

miRNA的形成的关键准之一miRNA应该来自一个的单链RNA的转录（27）。

然而，一些前体miRNA的序列匹配在正义和反义方向和miRNA的序列相一致，当sRNAs序列和前体序列（版本11.0）相比较，说明他们可能不是真正的miRNA。

此外，大多数miRNA的基因位点似乎是重复序列。

269个miRNA的基因位点中，其中91个前体被注明为转座子重复序列，其中大多数是小的反向重复（MITEs，表S8的;转座子50）。

 符合miRNA的前体的sRNAs可分为（表，S9）几类。

对于好的miRNA的，大多数sRNAs最应该来自于成熟miRNAs或miRNA的有义位置。

我们的分析来自水稻种子（本研究），花卉，苗木和茎（24）的sRNAs序列表明，包含miRNA的基因位点的重复序列与那些没有重复的序列，至少在两个方面有所不同。

首先，反义sRNAs来源于包含重复序列的miRNA的位点产生了相当于有义sRNAs;第二，许多sRNAs来源于这些位点而不是成熟miRNA或miRNAs（表S9）。

这表明，有义重复序列含miRNA的基因位点可能是由两个链随意生成的或边缘miRNA（8）生成。

关注3种miRNA（osa-MIR531,osa-MIR1426andosa-MIR1431）是有意义的，它们只能从成熟miRNA上形成sRNAs，也被视为（表加S9）重复序列。

因此，在本研究对miRNA的理解，所有包含重复的序列或推测在两个方向上有同样丰富度的与前体匹配的sRNAs的序列被排除在外。

两个注明的miRNA基因位点，MIR169p和OSA-MIR169q，和其他的明显（表S9）不同，因为它们从成熟miRNA和miRNA产生许多反义sRNAs。

在生成的sRNAs，有些是在定位于基因组的唯一基因，表明这两个miRNA的可能从反义序列的miRNA的基因位点转录。

对所有osa-miR169家族成员的前体序列和MIR169p和OSA-MIR169q的反向互补序列。

这表明osa-MIR169p和OSA-MIR169q方向可能是错误的注明在miRBase（小RNA数据库）（版本11.0）。

许多保守的miRNA的家族有多个旁系同源位点，其中一些形成与成熟的miRNA相同，因此很难确定这些基因从成熟miRNA的哪个位点产生。

此外，对miRNA_s和miRNA位点的罕见的副产品基因位点检测，将有助于确认（11）独特位点的基因表达。

通过从种子和其他组织获得标记序列（8,24）到前体miRNA，通过47个miRNA的家庭所得的96个位点被证实是基因组上的稀有序列（表S10的）。

此外，我们的分析表明，对osa-miR156j和osa-miR166j的独特序列标记被确认分别在osa-miR156h和osa-miR166i上。

考虑到osa-miR156j和osamiR166j没有成功标记到基因组（TIGR的4.0），其中位点可能与osa-miR156h和OSA-miR166i是相同的。

在与前体miRNA的独特序列相一致的序列，在不同的环境一些与前体相匹配。

每个基因组上的独特序列的来源表明，它们可能会产来源于唯一的一个位点（表，S11）。

同样，分析拟南芥（ArabidopsisSmallRNAProject，ASRP，http:

//asrp.cgrb.oregonstate。

词典/）和线虫（基因库的数据，格鲁吉亚加入数GSE5990，样品GSM139137）显示，这种现象常见于不同品种，许多sRNAs可以和成熟miRNA的或反义方向（图2B）的miRNAs相匹配。

最近的一份报告表明，在果蝇的单一的Hox位点通过反向的DNA链产生功能性的miRNA基因（51），指出这一现象在整个动物和植物王国是很保守的。

鉴定26个新的miRNA和12个候选的miRNAs

要确定新的miRNA的基因位点，通过这项研究相同基因组的sRNA周边环境是一致的，并且每个序列的二级结构通过Mfold程序（28）的帮助而预测。

一个Perl脚本被用来根据MIRcheck的标准评估配对地区的RNA的二级结构预测（38）。

假定miRNA的基因位点的序列，然后通过RepeatMasker分析排除重复序列。

这些没有重复序列的被作为候选前体并且进一步分析。

此前曾报道，miRNA_s的积累是DCLs在控制的分裂在miRNA的生物合成过程中的强有力的证据（11），因此本研究miRNA的鉴定主要是通过miRNA_s的检测。

11个新的miRNA的基因位点最终确定，不包括3个miRNA（osamiR810b.1,osa-miR1429和osa-miR1432;引用8日和26日，这期间出版的修订稿）。

有趣的是，种子库中的osa-miR1429_（126TPQ）均高于osa-miR1429（15TPQ），这表明了miRNA_s在不同组织中的积累量可能会有所不同。

此外，被Lu等报道的在其他六个库的sRNAs序列（8）被用来检查存在的miRNA_s，导致在其他8个miRNA位点的的鉴定（见表2）。

 两个候选前体sRNAs有很高的量（>180TPQ）被确定为miRNAs（osa-miR827b和osa-miR1859），其中osa-miR827b与拟南芥athmiR827直接同源。

通过表达序列标签与候选前体的比较表明5个以前未确实的非编码RNA确实是miRNA。

六个前体，与表达序列标签相匹配并且以前被视为'保守假设蛋白'，被确定为候选的miRNA（osa-miRc1-c6）。

此外，6个候选miRNA的量大于15TPQ已经被确定。

做为一个整体。

，26个新的（表2）和12个候选德miRNA（表的S12）在本研究都被鉴定（预测的结构如补充数据集1所示）。

在新发现的miRNAs中，osa-miR396f是osa-miR396家族的一个同源体，是两个新的miRNAs的其中的一个，在其他物种中有直系同源。

正如在图2c所示，miR396基因按照成熟miRNA的序列可分为两个亚组。

这两个在玉米中新的未确认的miRNA，zmamiR396c来自于AZM5_13014而zma-miR396d来自于AZM5_11578，osa-miR396d-e比osa-miR396a-c更为保守。

osa-miR827b在水稻和拟南芥中都是保守的。

在miRBase（V11.0），osa-miR827，最近通过相似性分析鉴定了miR827（52），但是，在成熟的miRNA没有sRNA或miRNA_s位点在osa-miR827的前体出现在种子库或其他公共库里。

相反，在osa-miR827b位点的成熟的miRNA在