动物遗传育种实验技术指导教材Word文档格式.docx

1、4.2 0.5M EDTA pH8.0 （1L: 800ml H2O中加186.1g 二水（EDTANa22H2O），用NaOH调 pH至8.0，定溶至 1 升）实验二 基因组DNA 提取一、目的 掌握提取DNA原理及方法二、概述 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白（DNP）形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子

2、等，从中分离DNA 。 DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。苯酚/氯仿作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多

3、次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态，真核细胞DNA的分离通常是在EDTA及SDS一类去污剂存在下， 用蛋白酶K消化细胞获得。三、主要试剂1、EDTA、SDS、SET、蛋白酶K2、Tris饱和酚、氯仿异戊醇（23：1）、无水乙醇、75%乙醇四、操作步骤1.30-40ul血液+470ulSET+12.5ul20%SDS+6ul蛋白酶K摇匀，55水浴过夜（按顺序加）；2.加苯酚500ul,10min摇匀,离心10000r/min 10min；3.抽上清，加500ul氯仿异戊醇（23：1）,20min摇匀,离心10000

4、r/min 10min；4.抽上清,加无水乙醇（冰冻）1000ul,摇匀，冷冻于-20（20分钟以上），离心10000r/min 2min；5.弃上清，加75%乙醇1000ul，离心10000r/min 2min；6.弃上清，55烘干，加TE（或ddH2O）300ul溶解DNA沉淀，4保存或电泳。附: 提DNA 所用试剂配方：1. 20% SDS （2L: 在2L热水中缓慢加 400g SDS，边加边搅拌，溶解后放置热地方保存）2. 5M NaCl （1L: 750ml H2O中加292.2g NaCl，溶解后定溶至1升， 灭菌）3. 100x TE （1L: 800ml H2O中加121.1

5、g Tris, 37.2 EDTA Na2 2H2O, 用HCl调 pH至8.0, 定溶， 灭菌）4. 50 TAE（1L: 500ml H2O中加242g Tris，溶解后加100ml 0.5M EDTA pH8.0和57.1ml冰醋酸，定溶）五、注意事项不同要求时可选择不同抽提方法提取DNA；注意实验安全实验三 核酸纯度、浓度与分子量测定了解测定核酸浓度、纯度的原理和操作方法。凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性条件下带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA

6、分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。线性DNA样品在凝胶中的迁移率与DNA的对数值成反比，可在电泳中加入核酸分子量标准来确定电泳后核酸的分子量。溴化乙锭（ethidium bromide，EB）是一种荧光染料，在凝胶电泳中，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下发出荧光,其强度与DNA量成正比。同时核酸最大吸收波长在260 nm，在此波长下，吸光度1 A相当于一定浓度的核酸，可以通过A260/A280 的比值，来测定所得核酸的纯度。三、材料 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，点样板，

7、微波炉，琼脂糖，TBE电泳缓冲液，TE buffer，溴化乙锭（EB），载样缓冲液，紫外分光光度仪，凝胶图象分析仪等（一） 紫外分光光度（Spectrophotometer）法：1. 将分光光度计打开，预热10分钟。2. 将核酸溶液中取2l，加（或纯水）使体积成为100l。3. 将稀释溶液加入石英管，以TE buffer（或纯水）为标准倒入另一管。4. 在波长260、280nm处测定吸光值。5. 比较在260nm及280nm之读值。（二） Ethidium bromide染色法：利用一系列不同浓度的DNA标准溶液（0、2.5、5、10、20、30、40、50 ng/l），或已知浓度的DNA m

8、arker，和未知浓度DNA样品一起进行琼脂糖凝胶电泳，以EB染色后，在凝胶图象分析仪上观察，比较标准浓度及未知浓度的亮度，来求取DNA 的含量；比较DNA样品与DNA marker条带位置，推知DNA 样品分子量。实验步骤主要包括制胶、点样以及电泳等过程。 1. 称取1.5g琼脂糖加入盛有100ml 0.5TBE电泳缓冲液三角瓶中，摇匀，在微波炉上加热至琼脂糖完全溶解。加入溴化乙锭（EB）至终浓度0.5ug/ml，并摇匀。2. 用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖倒入，室温冷却凝固。3. 充分凝固后撕掉两端的胶布，垂直向上小心拔出梳子，以保证点样孔完好。凝胶置入电泳槽中，加0

9、.5TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。4. 用移液器吸取DNA样品8l与 2l 的载样缓冲液混匀，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。同时点10l DNA Marker作为分子量标准。5. 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到条带由负极向正极移动，约半小时后即可观察。6. 在凝胶图象分析仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小；同时比较标准浓度及未知浓度的亮度，求取DNA 的含量。1、A260/A2801.8表示DNA/RNA的纯度高。若数值1.8，表示纯度低，这时由OD260测得的DNA含量较不可信，核酸溶液中含有较多蛋白质，因此最好将前述

10、所得核酸再重新抽取。2. 测定260nm吸光值，OD=1.0代表值如下：1） ds DNA （double stranded DNA） = 50 g/ml2） ss DNA （single stranded DNA or simgle-stranded RNA） = 40 g/ml3） oligonucleotide = 33 g/ml3. EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。实验四 PCR及RT-PCR 掌握聚合酶链式反应（PCR） 及逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）的基本方法二、原理 PCR用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。在由Taq DNA聚合酶催化的一系列合成反应

11、中，使用两段寡核苷酸作为反应的引物。一般情况下，这两段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补，而这两段模板序列又分别位于待扩增的两侧。反应时它包括三个基本步骤: （1） 变性（Denature）:目的双链DNA 片段在94下解链; （2） 退火（Anneal）:两种寡核苷酸引物在适当温度（50左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对;（3） 延伸（Extension）:在Taq DNA 聚合酶合成DNA 的最适温度下,以目的DNA 为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍（图4）,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮

12、循环的模板,所以经25-35 轮循环就可使DNA 扩增达106 倍。 RNA的多聚酶链式反应（RT-PCR）是以RNA为模板，联合逆转录反应（reverse transcription, RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的特异DNA，为RNA病毒检测提供了方便；并为获得与扩增特定的RNA互补的cDNA提供了一条极为有利和有效的途径。RNA扩增包括两个步骤：在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补链cDNA；加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA。 在RT-PCR中关键步骤是RNA的

13、逆转录，cDNA的PCR与一般PCR条件一样。由于引物的高度选择性，细胞总RNA无需进行分级分离，即可直接用于RNA的PCR。但RT-PCR对RNA制品的要求极为严格，作为模板的RNA分子必须是完整的，并且不含DNA、蛋白质和其它杂质。RNA中即使含有极微量的DNA，经扩增后也会出现非特异性扩增；蛋白质未除净，与RNA结合后会影响逆转录和PCR；残存的RNase极易将膜板RNA降解掉。硫氰酸胍（GaSCN）-CsCl法或酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法可提得理想的RNA制品，尤以后者方法为佳，适合一般实验室进行。常用的逆转录酶有两种，即禽类成髓细胞性白血病病毒（Avian myeloblastosis

14、 virus, AMV）和莫洛尼鼠类白血病病毒（Moloney murine leukemia virus, MO-MLV）的逆转录酶（RT）。一般情况下用Mo-MLV-RT较多，但模板RNA的二级结构严重影响逆转录时，可改用AMV-RT，因后者最适温度为72，高于Mo-MLV-RT的最适温度（37），而较高的反应温度有助于消除RNA的二级结构。 一步法扩增（one step amplification）是为了检测低丰度mRNA的表达，利用同一种缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP直接进行mRNA反转录与PCR扩增。发现Taq酶不仅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反转

15、录酶活性，可利用其双重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后的PCR扩增，从而使mRNA的PCR步骤更为简化，所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA。该法还可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cDNA的克隆，并有可能与Taq酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在一个试管中进行。三、材料（一） 仪器1. PCR仪2. 台式高速离心机3. 电泳仪、电泳槽4. 凝胶成像仪（二） 塑料器皿吸头、96孔板、PCR管、离心管（三） 其他物品微量加样枪（2.5 l、10l和100l各1支

16、） （四） 试剂1. 10PCR缓冲液（不含MgCl2）2. 5mmol/LdNTPs,4种dNTP每种浓度均为2.5mmol/L3. Taq DNA聚合酶（5u/ul）4. MgCl2，25mmol/L5. 5TBE电泳缓冲液6. 10g/L溴化乙锭7. 1%2%琼脂糖凝胶（浓度视待扩增的DNA片段大小而定）8. 两对套叠式引物（一） 以DNA为模板的PCR扩增反应1. 按以下次序，将各成分在0.2ml Eppendorf管中混合：1） 模板DNA（100mg/L） 1ul 2） 2Eco Taq PCR SuperMix 5ul 3） Forward Primer 0.1ul 4） Rev

17、erse Primer 0.1ul5） ddH2O up to 10 ul 2. 将溶液混匀3. 按以下方法进行扩增。1 94 3min94 30s5060 30s72 1kb/min（3035 cycles）2 72 5-10min3 16 forever4. 将扩增产物DNA进行凝胶电泳 （二） 以mRNA为模板的PCR扩增反应1. 设置合成cDNA第一链的反应：1） 4扩增缓冲液 2.0ul2） 2.5mmol/LdNTP 2.0ul3） Oligo（dT）12-18（100mg/L） 0.5ul4） RNAinhibitor 20U5） mRNA 1ul 6） 25mmol/L MgC

18、l2 2ul7） 加水至终体积 20ul*可用10-50pmol随机引物代替Oligo（dT）作为引物。2. 将溶液混匀，以15 000r/min离心10秒钟，将反应混合液置65变性5 min，使mRNA均变为单链。3. 将100-200单位MMLV反转录酶加入混合物中，混匀，将反应混合物置37温育30min。4. 将温育后产物cDNA取出一部分按照以DNA为模板的PCR扩增反应步骤进行预定循环数的扩增反应。1. PCR引物摩尔数的计算 在PCR反应中，引物的量是以pmol数表示的，而合成引物后，引物的量是以OD值表示的。因此，需经适当换算，才能配置适当浓度的引物溶液。换算公式如下：1） OD

19、值为1的引物约为33ug。2） 引物的分子量=碱基数330 3） 引物pmol数=OD值331000 000= OD值1000 004） 碱基数330 碱基数3302. 结果假阴性：出现假阴性结果最常见的原因是：Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统欠妥当；循环次数不够。所以在实验中出现假阴性失败时，首先在原来扩增的产物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循环，一般都会获得成功。如果没有成功应检查PCR扩增仪的温度是否准确，采集标本是否有问题。为了防止假阴性的出现在选用Taq DNA聚合酶时，要注意用活力高质量好的酶。同时

20、在提取PCR模板时，应特别注意防止污染抑制酶活性物质（如酚、氯仿）的存在。尽管Taq DNA聚合酶对模板纯度要求不高，但也不允许有破坏性有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件及特异性是引物与靶DNA良好的互补，尤其是要绝对保证引物的3端与靶基因的互补。对变异较大的扩增对象，宜采用巢式（Nested）PCR或double PCR。在进行PCR操作时应注意Mg2+的浓度要合理。PCR反应的各温度点的设置要合理。3. 结果假阳性：PCR结果的假阳性是对被检测标本而言，而反应系统中所扩增的产物是真实的。因为PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成大量扩增，而造成结果判断上的失误，所以污染是PCR

21、假阳性的主要根源。PCR的污染主要是标本间的交叉污染和扩增子的污染。出现假阳性结果的另一种可能是样品中存在有靶基因的同源序列。为了避免因污染而造成的假阳性，PCR操作时要隔离不同操作区、分装试剂、简化操作程序，使用一次性吸头。实验五 DNA片段的回收和纯化 掌握从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段的原理及方法 在高离子盐存在的情况下，DNA片段选择性地吸附于离心柱内的硅基质膜上，再通过一系列快速的漂洗离心的步骤去蛋白液和漂洗液将引物、核苷酸、蛋白酶等杂质去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净DNA从硅基质膜上洗脱。三、试剂及材料北京百泰克快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒II（离心柱型）第一次使

22、用前先在漂洗液WB中加入瓶子标签指定量无水乙醇。1. 配制琼脂糖凝胶,电泳以分离DNA片段。2. 电泳足够时间后，在紫外灯下小心地把所需的DNA片段切下来，并尽量去除多余的凝胶。 注意：DNA在紫外灯下的曝光的时间不要超过30秒 3. 切下带目的片段的凝胶装在1.5ml离心管中并称其重量，近似地确定其体积。加入等倍凝胶体积的溶胶/结合液DB，把混合物置于56水浴中温浴3-5min至凝胶完全融化，其间每隔1-2分钟混匀一次。4. 将上一步所得溶液加入微量吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液。 如果总体积超过900l，可分两次将溶液加入同一微量吸附

23、柱中。5. 加入900l漂洗液WB，12,000rpm离心1min，弃掉废液。6. 将微量吸附柱放回空收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。7. 取出微量吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加15-30l洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70水浴中加热），室温放置2min，12,000rpm离心1min。如果需要较多量DNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1min。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于10l，体积过小降低DNA洗脱效率，减少产量。掌握外源D

24、NA片段和质粒载体的连接反应的方法。二、 概述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段（10kb且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗

25、传学手段如互补现象等来鉴别重组子和非重组子。三、材料及试剂（一） 材料 1. 外源DNA片段2. 载体DNA: pGEM-T Easy Vector3. 宿主菌: E.coliDH5,或JM系列等具有-互补能力的菌株。（二） 设备 1. 恒温摇床3. 恒温水浴锅4. 琼脂糖凝胶电泳装置5. 电热恒温培养箱6. 电泳仪无菌7. 工作台8. 微量移液枪9. eppendorf管 （三） 试剂1. LB固体和液体培养基 2. T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）；购买成品。3. 含Amp LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug

26、/ml,摇匀后铺板。（一） 连接反应 2Rapid Ligation Buffer，T4 DNA ligase 5lpGEM-T Easy Vector 1lPCR product 3lT4 DNA ligase 1l4连接过夜。（二）转化1. 加5l连接产物于30l感受态细胞中（冰浴融化），轻弹混匀，冰浴30min（冰上操作）2. 42热激30s，立即置于冰上2min3. 加至700l平衡至室温的LB液体培养基，37摇床200rpm，培养1h4. 铺板:取100l菌液铺板至LA固体培养基，37培养过夜。（三） 重组质粒的筛选 1. 每组连接反应转化原液取100l用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基

27、上,37下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。2. 倒置平板于37继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。3. 不带有pGEM-T质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活。（四） PCR菌液鉴定重组质粒 4. 挑取白色单菌落接种于含Amp 50g/ml的 700l LA液体培养基中,37下振荡培养3小时。5. 取1l菌液作为模板进行PCR扩增，并电泳检测。1. 连接反应后，反应液在0储存数天，-80储存2个月，但是在-20冰冻保存将会降低转化效率。2. 粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温度为37，

28、在连接粘性末端时，反应温度以10-16为好，平齐末端则以15-20为好。3. 在连接反应中，如不对载体分子进行去5磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。 掌握质粒DNA提取的原理及方法质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。质粒DNA小量提取试剂盒的原理是：采用改进SDSS碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐。低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液

29、和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。北京百泰克高纯质粒小量制备试剂盒、RNase A第一次使用前先在15ml漂洗液WB中加入45ml无水乙醇。将RNAase A全部加入溶液P1中，混匀，每次使用后置于2-8保存。1. 取1.5-4.5ml 过夜培养的菌液，9，000rpm离心30s，弃上清，收集菌体，尽可能倒干上清。 处理超过1.5ml菌液可以离心弃上清后，在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直至收集到足够的菌体。2. 用250l溶液P1中重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。 如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。3. 加250l的溶液P2，温和地上下翻转6-10次使菌体充分裂解，直到溶液变得清亮。 温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应