动物遗传育种实验技术指导教材Word文档格式.docx
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4.20.5MEDTApH8.0(1L:
800mlH2O中加186.1g二水(EDTANa2·
2H2O),用NaOH调pH至8.0,定溶至1升)
实验二基因组DNA提取
一、目的
掌握提取DNA原理及方法
二、概述
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于水,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂,它们的钠盐比游离酸易溶于水,RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。
DNA在水中为10g/L,呈黏性胶体溶液。
在酸性溶液中,DNA天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。
要从细胞中提取DNA时,先把DNP抽提出来,再把P除去,再除去细胞中的糖,RNA及无机离子等,从中分离DNA。
DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。
DNP在低浓度盐溶液中,几乎不溶解,如在0.14mol/L的氯化钠溶解度最低,仅为在水中溶解度的1%,随着盐浓度的增加溶解度也增加,至1mol/L氯化钠中的溶解度很大,比纯水高2倍。
RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小,在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。
因此,在提取时,常用此法分离这两种核蛋白。
苯酚/氯仿作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。
离心分层后取出水层,多次重复操作,再合并含DNA的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀DNA。
此法的特点是使提取的DNA保持天然状态,真核细胞DNA的分离通常是在EDTA及SDS一类去污剂存在下,用蛋白酶K消化细胞获得。
三、主要试剂
1、EDTA、SDS、SET、蛋白酶K
2、Tris饱和酚、氯仿异戊醇(23:
1)、无水乙醇、75%乙醇
四、操作步骤
1.30-40ul血液+470ulSET+12.5ul20%SDS+6ul蛋白酶K→摇匀,55℃水浴过夜(按顺序加);
2.加苯酚500ul,10min摇匀,离心10000r/min10min;
3.抽上清,加500ul氯仿异戊醇(23:
1),20min摇匀,离心10000r/min10min;
4.抽上清,加无水乙醇(冰冻)1000ul,摇匀,冷冻于-20℃(20分钟以上),离心10000r/min2min;
5.弃上清,加75%乙醇1000ul,离心10000r/min2min;
6.弃上清,55℃烘干,加TE(或ddH2O)300ul溶解DNA沉淀,4℃保存或电泳。
附:
提DNA所用试剂配方:
1.20%SDS
(2L:
在2L热水中缓慢加400gSDS,边加边搅拌,溶解后放置热地方保存)
2.5MNaCl(1L:
750mlH2O中加292.2gNaCl,溶解后定溶至1升,灭菌)
3.100xTE(1L:
800mlH2O中加121.1gTris,37.2EDTANa22H2O,用HCl调pH至8.0,定溶,灭菌)
4.50×
TAE(1L:
500mlH2O中加242gTris,溶解后加100ml0.5MEDTApH8.0和57.1ml冰醋酸,定溶)
五、注意事项
不同要求时可选择不同抽提方法提取DNA;
注意实验安全
实验三核酸纯度、浓度与分子量测定
了解测定核酸浓度、纯度的原理和操作方法。
凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,沸水中溶解,45℃开始形成多孔性刚性滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性条件下带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。
不同的DNA,其分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带。
线性DNA样品在凝胶中的迁移率与DNA的对数值成反比,可在电泳中加入核酸分子量标准来确定电泳后核酸的分子量。
溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)是一种荧光染料,在凝胶电泳中,EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间,在紫外线激发下发出荧光,其强度与DNA量成正比。
同时核酸最大吸收波长在260nm,在此波长下,吸光度1A相当于一定浓度的核酸,可以通过A260/A280的比值,来测定所得核酸的纯度。
三、材料
电泳仪,电泳槽,电子天平,移液器,枪头,点样板,微波炉,琼脂糖,TBE电泳缓冲液,TEbuffer,溴化乙锭(EB),载样缓冲液,紫外分光光度仪,凝胶图象分析仪等
(一)紫外分光光度(Spectrophotometer)法:
1.将分光光度计打开,预热10分钟。
2.将核酸溶液中取2µ
l,加(或纯水)使体积成为100µ
l。
3.将稀释溶液加入石英管,以TEbuffer(或纯水)为标准倒入另一管。
4.在波长260、280nm处测定吸光值。
5.比较在260nm及280nm之读值。
(二)Ethidiumbromide染色法:
利用一系列不同浓度的DNA标准溶液(0、2.5、5、10、20、30、40、50ng/l),或已知浓度的DNAmarker,和未知浓度DNA样品一起进行琼脂糖凝胶电泳,以EB染色后,在凝胶图象分析仪上观察,比较标准浓度及未知浓度的亮度,来求取DNA的含量;
比较DNA样品与DNAmarker条带位置,推知DNA样品分子量。
实验步骤主要包括制胶、点样以及电泳等过程。
1.称取1.5g琼脂糖加入盛有100ml0.5×
TBE电泳缓冲液三角瓶中,摇匀,在微波炉上加热至琼脂糖完全溶解。
加入溴化乙锭(EB)至终浓度0.5ug/ml,并摇匀。
2.用胶带将制胶板两端封好,插入适当梳子,将溶解的琼脂糖倒入,室温冷却凝固。
3.充分凝固后撕掉两端的胶布,垂直向上小心拔出梳子,以保证点样孔完好。
凝胶置入电泳槽中,加0.5×
TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。
4.用移液器吸取DNA样品8μl与2μl的载样缓冲液混匀,小心加入点样孔,蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。
同时点10μlDNAMarker作为分子量标准。
5.打开电源开关,调节电压至3-5V/cm,可见到条带由负极向正极移动,约半小时后即可观察。
6.在凝胶图象分析仪上观察电泳带及其位置,并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小;
同时比较标准浓度及未知浓度的亮度,求取DNA的含量。
1、A260/A280>
1.8表示DNA/RNA的纯度高。
若数值<
1.8,表示纯度低,这时由OD260测得的DNA含量较不可信,核酸溶液中含有较多蛋白质,因此最好将前述所得核酸再重新抽取。
2.测定260nm吸光值,OD=1.0代表值如下:
1)dsDNA(doublestrandedDNA)=50g/ml
2)ssDNA(singlestrandedDNAorsimgle-strandedRNA)=40g/ml
3)oligonucleotide=33g/ml
3.EB是致癌物质,切勿用手接触,更不要污染环境。
实验四PCR及RT-PCR
掌握聚合酶链式反应(PCR)及逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的基本方法
二、原理
PCR用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。
在由TaqDNA聚合酶催化的一系列合成反应中,使用两段寡核苷酸作为反应的引物。
一般情况下,这两段寡核苷酸引物的序列互不相同,并分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补,而这两段模板序列又分别位于待扩增的两侧。
反应时它包括三个基本步骤:
(1)变性(Denature):
目的双链DNA片段在94℃下解链;
(2)退火(Anneal):
两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;
(3)延伸(Extension):
在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍(图4),这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106倍。
RNA的多聚酶链式反应(RT-PCR)是以RNA为模板,联合逆转录反应(reversetranscrip-tion,RT)与PCR,可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的特异DNA,为RNA病毒检测提供了方便;
并为获得与扩增特定的RNA互补的cDNA提供了一条极为有利和有效的途径。
RNA扩增包括两个步骤:
①在单引物的介导下和逆转录酶的催化下,合成RNA的互补链cDNA;
②加热后cDNA与RNA链解离,然后与另一引物退火,并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA,最后扩增靶DNA。
在RT-PCR中关键步骤是RNA的逆转录,cDNA的PCR与一般PCR条件一样。
由于引物的高度选择性,细胞总RNA无需进行分级分离,即可直接用于RNA的PCR。
但RT-PCR对RNA制品的要求极为严格,作为模板的RNA分子必须是完整的,并且不含DNA、蛋白质和其它杂质。
RNA中即使含有极微量的DNA,经扩增后也会出现非特异性扩增;
蛋白质未除净,与RNA结合后会影响逆转录和PCR;
残存的RNase极易将膜板RNA降解掉。
硫氰酸胍(GaSCN)-CsCl法或酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法可提得理想的RNA制品,尤以后者方法为佳,适合一般实验室进行。
常用的逆转录酶有两种,即禽类成髓细胞性白血病病毒(Avianmyeloblastosisvirus,AMV)和莫洛尼鼠类白血病病毒(Moloneymurineleukemiavirus,MO-MLV)的逆转录酶(RT)。
一般情况下用Mo-MLV-RT较多,但模板RNA的二级结构严重影响逆转录时,可改用AMV-RT,因后者最适温度为72℃,高于Mo-MLV-RT的最适温度(37℃),而较高的反应温度有助于消除RNA的二级结构。
一步法扩增(onestepamplification)是为了检测低丰度mRNA的表达,利用同一种缓冲液,在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP直接进行mRNA反转录与PCR扩增。
发现Taq酶不仅具有DNA多聚酶的作用,而且具有反转录酶活性,可利用其双重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后的PCR扩增,从而使mRNA的PCR步骤更为简化,所需样品量减少到最低限度,临床小样品的检测非常有利。
用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA。
该法还可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cD-NA的克隆,并有可能与Taq酶的测序技术相组合,使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在一个试管中进行。
三、材料
(一)仪器
1.PCR仪
2.台式高速离心机
3.电泳仪、电泳槽
4.凝胶成像仪
(二)塑料器皿
吸头、96孔板、PCR管、离心管
(三)其他物品
微量加样枪(2.5μl、10μl和100μl各1支)
(四)试剂
1.10×
PCR缓冲液(不含MgCl2)
2.5mmol/LdNTPs,4种dNTP每种浓度均为2.5mmol/L
3.TaqDNA聚合酶(5u/ul)
4.MgCl2,25mmol/L
5.5×
TBE电泳缓冲液
6.10g/L溴化乙锭
7.1%〜2%琼脂糖凝胶(浓度视待扩增的DNA片段大小而定)
8.两对套叠式引物
(一)以DNA为模板的PCR扩增反应
1.按以下次序,将各成分在0.2mlEppendorf管中混合:
1)模板DNA(100mg/L)1ul
2)2×
EcoTaqPCRSuperMix5ul
3)ForwardPrimer0.1ul
4)ReversePrimer0.1ul
5)ddH2Oupto10ul
2.将溶液混匀
3.按以下方法进行扩增。
194℃3min
94℃30s
50~60℃30s
72℃1kb/min
(30~35cycles)
272℃5-10min
316℃forever
4.将扩增产物DNA进行凝胶电泳
(二)以mRNA为模板的PCR扩增反应
1.设置合成cDNA第一链的反应:
1)4×
扩增缓冲液2.0ul
2)2.5mmol/LdNTP2.0ul
3)Oligo(dT)12-18(100mg/L)0.5ul
4)RNAinhibitor20U
5)mRNA1ul
6)25mmol/LMgCl22ul
7)加水至终体积20ul
*可用10-50pmol随机引物代替Oligo(dT)作为引物。
2.将溶液混匀,以15000r/min离心10秒钟,将反应混合液置65℃变性5min,使mRNA均变为单链。
3.将100-200单位MMLV反转录酶加入混合物中,混匀,将反应混合物置37℃温育30min。
4.将温育后产物cDNA取出一部分按照以DNA为模板的PCR扩增反应步骤进行预定循环数的扩增反应。
1.PCR引物摩尔数的计算在PCR反应中,引物的量是以pmol数表示的,而合成引物后,引物的量是以OD值表示的。
因此,需经适当换算,才能配置适当浓度的引物溶液。
换算公式如下:
1)OD值为1的引物约为33ug。
2)引物的分子量=碱基数×
330
3)引物pmol数=OD值×
33×
1000000=OD值×
100000
4)碱基数×
330碱基数×
330
2.结果假阴性:
出现假阴性结果最常见的原因是:
TaqDNA聚合酶活力不够,或活性受到抑制;
引物设计不合理;
提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统欠妥当;
循环次数不够。
所以在实验中出现假阴性失败时,首先在原来扩增的产物中再加入TaqDNA聚合酶、增加5-10次循环,一般都会获得成功。
如果没有成功应检查PCR扩增仪的温度是否准确,采集标本是否有问题。
为了防止假阴性的出现在选用TaqDNA聚合酶时,要注意用活力高质量好的酶。
同时在提取PCR模板时,应特别注意防止污染抑制酶活性物质(如酚、氯仿)的存在。
尽管TaqDNA聚合酶对模板纯度要求不高,但也不允许有破坏性有机试剂的污染。
PCR扩增的先决条件及特异性是引物与靶DNA良好的互补,尤其是要绝对保证引物的3′端与靶基因的互补。
对变异较大的扩增对象,宜采用巢式(Nested)PCR或doublePCR。
在进行PCR操作时应注意Mg2+的浓度要合理。
PCR反应的各温度点的设置要合理。
3.结果假阳性:
PCR结果的假阳性是对被检测标本而言,而反应系统中所扩增的产物是真实的。
因为PCR技术高度灵敏,极其微量的靶基因污染都会造成大量扩增,而造成结果判断上的失误,所以污染是PCR假阳性的主要根源。
PCR的污染主要是标本间的交叉污染和扩增子的污染。
出现假阳性结果的另一种可能是样品中存在有靶基因的同源序列。
为了避免因污染而造成的假阳性,PCR操作时要隔离不同操作区、分装试剂、简化操作程序,使用一次性吸头。
实验五DNA片段的回收和纯化
掌握从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段的原理及方法
在高离子盐存在的情况下,DNA片段选择性地吸附于离心柱内的硅基质膜上,再通过一系列快速的漂洗—离心的步骤去蛋白液和漂洗液将引物、核苷酸、蛋白酶等杂质去除,最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净DNA从硅基质膜上洗脱。
三、试剂及材料
北京百泰克快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒II(离心柱型)
第一次使用前先在漂洗液WB中加入瓶子标签指定量无水乙醇。
1.配制琼脂糖凝胶,电泳以分离DNA片段。
2.电泳足够时间后,在紫外灯下小心地把所需的DNA片段切下来,并尽量去除多余的凝胶。
注意:
DNA在紫外灯下的曝光的时间不要超过30秒
3.切下带目的片段的凝胶装在1.5ml离心管中并称其重量,近似地确定其体积。
加入等倍凝胶体积的溶胶/结合液DB,把混合物置于56℃水浴中温浴3-5min至凝胶完全融化,其间每隔1-2分钟混匀一次。
4.将上一步所得溶液加入微量吸附柱中(吸附柱放入收集管中),12,000rpm离心30-60s,倒掉收集管中的废液。
如果总体积超过900μl,可分两次将溶液加入同一微量吸附柱中。
5.加入900μl漂洗液WB,12,000rpm离心1min,弃掉废液。
6.将微量吸附柱放回空收集管中,12,000rpm离心2min,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
7.取出微量吸附柱,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加15-30μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热),室温放置2min,12,000rpm离心1min。
如果需要较多量DNA,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,离心1min。
洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于10μl,体积过小降低DNA洗脱效率,减少产量。
掌握外源DNA片段和质粒载体的连接反应的方法。
二、概述
质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。
如果要克隆较小的DNA片段(<10kb=且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。
在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的,先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段,然后体外使两者相连接,再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。
但在实际工作中,如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。
通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。
三、材料及试剂
(一)材料
1.外源DNA片段
2.载体DNA:
pGEM-TEasyVector
3.宿主菌:
E.coliDH5α,或JM系列等具有α-互补能力的菌株。
(二)设备
1.恒温摇床
3.恒温水浴锅
4.琼脂糖凝胶电泳装置
5.电热恒温培养箱
6.电泳仪无菌
7.工作台
8.微量移液枪
9.eppendorf管
(三)试剂
1.LB固体和液体培养基
2.T4DNA连接酶(T4DNAligase);
购买成品。
3.含AmpLB固体培养基:
将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
(一)连接反应
2×
RapidLigationBuffer,T4DNAligase5μl
pGEM-TEasyVector1μl
PCRproduct3μl
T4DNAligase1μl
4℃连接过夜。
(二)转化
1.加5μl连接产物于30μl感受态细胞中(冰浴融化),轻弹混匀,冰浴30min(冰上操作)
2.42℃热激30s,立即置于冰上2min
3.加至700μl平衡至室温的LB液体培养基,37℃摇床200rpm,培养1h
4.铺板:
取100μl菌液铺板至LA固体培养基,37℃培养过夜。
(三)重组质粒的筛选
1.每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。
2.倒置平板于37℃继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。
3.不带有pGEM-T质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活。
(四)PCR菌液鉴定重组质粒
4.挑取白色单菌落接种于含Amp50μg/ml的700μlLA液体培养基中,37℃下振荡培养3小时。
5.取1μl菌液作为模板进行PCR扩增,并电泳检测。
1.连接反应后,反应液在0℃储存数天,-80℃储存2个月,但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。
2.粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定,所以尽管T4DNA连接酶的最适反应温度为37℃,在连接粘性末端时,反应温度以10-16℃为好,平齐末端则以15-20℃为好。
3.在连接反应中,如不对载体分子进行去5'
磷酸基处理,便用过量的外源DNA片段(2-5倍),这将有助于减少载体的自身环化,增加外源DNA和载体连接的机会。
掌握质粒DNA提取的原理及方法
质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。
这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
质粒DNA小量提取试剂盒的原理是:
采用改进SDSS碱裂解法裂解细胞,离心吸附柱内的硅基质膜在高盐。
低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
北京百泰克高纯质粒小量制备试剂盒、RNaseA
第一次使用前先在15ml漂洗液WB中加入45ml无水乙醇。
将RNAaseA全部加入溶液P1中,混匀,每次使用后置于2-8℃保存。
1.取1.5-4.5ml过夜培养的菌液,9,000rpm离心30s,弃上清,收集菌体,尽可能倒干上清。
处理超过1.5ml菌液可以离心弃上清后,在同一个1.5ml管内加入更多的菌液,重复步骤1,直至收集到足够的菌体。
2.用250μl溶液P1中重悬菌体沉淀,涡旋振荡至彻底悬浮。
如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。
3.加250μl的溶液P2,温和地上下翻转6-10次使菌体充分裂解,直到溶液变得清亮。
温和地混合,不要剧烈震荡,以免基因组DNA剪切断裂!
所用时不应