MMTV与ClC3转基因鼠杂交品系的建立及鉴定中国试验动物学报.docx

1、MMTV与ClC3转基因鼠杂交品系的建立及鉴定中国试验动物学报CLCN3/MMTV-PyMT转基因小鼠杂交群体的建立及鉴定邓璐璐1, 李琴3, 吴慧1, 毛建文1，徐彬2(1,广东药学院基础学院 广东 广州 510006.2,生命科学与生物制药学院 广东 广州 510006. 3, 贵州省六盘水市人民医院 贵州 六盘水 553001)摘 要目的：建立并鉴定CLCN3/MMTV-PyMT双转基因小鼠杂交群体，构建氯通道ClC-3过表达的自发乳腺肿瘤转基因小鼠模型。 方法：将CLCN3转基因小鼠和MMTV-PyMT转基因小鼠分别进行繁殖，选取阳性子代鼠进行配对，培育杂交后代 ，然后通过PCR鉴定基

2、因型、通过组织免疫荧光方法、Western-blot检测转基因小鼠蛋白表达情况。 结果：成功繁育CLCN3转基因小鼠和MMTV-PyMT转基因小鼠，经PCR鉴定成功构建CLCN3/MMTV-PyMT双转基因鼠杂交群体,并成功保种和扩群，经组织免疫荧光和western-blot分析双转基因小鼠的ClC-3蛋白的表达高于MMTV-PyMT转基因小鼠。结论：成功构建ClC-3过表达的自发乳腺肿瘤转基因小鼠模型，为进一步研究ClC-3在肿瘤生长和转移中的功能提供了良好的动物模型。关键词 CLCN3; MMTV-PyMT; 转基因小鼠; 乳腺癌【中图分类号】-332 【文献标识码】A基金项目：国家自然科

3、学基金项目（31371144）作者简介：邓璐璐(1989-),女, 硕士研究生，研究方向：离子通道转化医学。E-mail：luluwenz通讯作者：徐彬。E-mail：xubin2003 Establishment and identification of ClC-3/MMTV-PyMT heterozygous mice DENG Lu-lu1, LI Qin3 ,WU Hui1, MAO Jian-wen1，XU Bin2(1,School of Basic Course, Guangzhou 510006,China; 2,School of Biosciences and Bioph

4、armaceutics,Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006,China; 3,The Peoples Hospital of Liupanshui City , Liupanshui 553001, China ) Abstract Objective To establish CLCN3/MMTV-PyMT double transgenic mice developed breast tumors with simultaneous over expression of ClC-3. Method CLCN3 tran

5、sgenic mice were crossed with MMTV-PyMT spontaneous mammary tumor model mice. The genotype was determined by PCR. The expression of ClC-3 in tissues was detected by immunofluorescence and western blot. Results CLCN3 and MMTV-PyMT transgenic mice were breed largely and CLCN3/MMTV-PyMT heterozygous mi

6、ce was establish successfully . The ClC-3 expression in CLCN3/MMTV-PyMT heterozygous mice is higher than MMTV-PyMT mice by immunofluorescence and western blot analysis. Conclusion Spontaneous breast cancer transgenic mice models with simultaneous over expression of ClC-3 were established successfull

7、y. The double transgenic mice provides a good animal model for further research of ClC - 3 in tumor growth and metastasis . Key word CLCN3; MMTV-PyMT; Transgenic mice; Breast cancer 离子通道如K+, Cl-, 和 Na+ 通道的高表达促进了细胞的生长和运动，进一步促进恶性肿瘤细胞的生长和转移,特别是氯离子通道在肿瘤生长和转移中扮演了重要的角色1。ClC氯通道（ClC chloride channel）是一类电压门控

8、性氯通道，目前在哺乳动物细胞中已发现九种家族成员，其中ClC-3是备受关注的一种。在乳腺癌组织中、人胶质瘤中氯离子通道ClC-3的表达都明显高于正常组织，并且不同恶性程度之间有明显差异，提示了ClC-3可能在肿瘤发生和发展过程中起了重要作用2, 3。近年的研究报道，细胞膜上的ClC-3介导了细胞的premitotic condensation（PMC）过程，参与细胞周期调控4, 5。Zuo W 用氯离子通道阻断剂NPPB抑制H2O2激活的氯电流，减少PC12细胞的凋亡，提示与容积调控相关的氯通道ClC-3可能参与肿瘤细胞的凋亡过程6。我们的研究也发现ClC-3在鼻咽癌细胞中作为容积激活性氯离子

9、通道，通过调节容积激活性氯离子电流促进肿瘤细胞的迁移，且发现阻断容积激活性氯离子通道以及下调ClC-3的表达都成功抑制鼻咽癌细胞的迁移，进一步表明了ClC-3与肿瘤细胞迁移密切相关7-9。这些结果从细胞水平上提示ClC-3可能参与肿瘤细胞的细胞周期、细胞凋亡和细胞迁移的调控，但ClC-3在体内肿瘤生长和转移中的作用尚未明确。因此，内源性过表达ClC-3的转基因小鼠为此方向的研究提供了不可替代的作用。本研究把CLCN3转基因小鼠和MMTV-PyMT自发性乳腺癌转基因小鼠杂交，构建了内源性ClC-3过表达的自发乳腺肿瘤小鼠模型，为进一步研究ClC-3在肿瘤生长和转移特别是乳腺癌生长和转移方面的研究

10、提供合适的动物模型。1. 材料与方法1.1 实验动物 ClC-3过表达转基因小鼠委托Cyagen biosciences公司构建，编号为TGS120401AH01.质粒名称为pLV.EX3d.P/neo-EF1A CLCN3 IRES/eGFP，携带GFP绿色荧光蛋白。MMTV-PyMT小鼠在南京大学模式动物研究院购买，品系为FVB/N-Tg,634Mul/J，2只雄性MMTV-PyMT转基因小鼠，2只雌性野生型FVB鼠，15-20周龄。3只雄性，5只雌性，15-20周龄。SPF环境饲养，每天紫外2小时，温度22-28，湿度40%-60%,昼夜交替。1.2 实验材料 真空包装饲料、垫料购于广中

11、医动物实验中心，鼠尾试剂盒（CW2094）购于康为世纪有限公司, Taq 酶(DRR037S)、DNA Marker DL1000(D526A)、琼脂糖购自大连宝生物工程有限公司。小鼠鉴定引物均由上海Invitrogen 公司合成（表 1）。免疫染色固定液(P0098)、免疫染色洗涤液（P0106），免疫染色一抗稀释液（P0103）、免疫染色二抗稀释液（P0108），免疫染色抗荧光淬灭封片液（P0126）、Alexa Fluor488标记山羊抗兔IG（H+L）（A0423）、GAPDH鼠源一抗（AG019-1）均购于碧云天，ClC-3兔源一抗(ab28736)购于abcam，羊抗鼠二抗（H23

12、11）、羊抗兔二抗(CO211)购于biotechnology公司，蛋白裂解液（K0301）购于thermo公司。1.3 转基因小鼠的整合检测 PCR方法鉴定转基因小鼠基因型。剪取三周龄小鼠尾尖，采用鼠尾DNA提取试剂盒提取基因组DNA，利用MMTV-PyMT和ClC-3特异性引物(如下表)进行PCR扩增。PCR体系分别加入PCR Mix酶25ul,PCR引物各1ul，模板DNA 1ug，ddH2O加到50ul。反应条件为：94预变性3min，94变性30s，退火641min，延伸721min，循环35次，72延伸2min，4保存。取10ulPCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统

13、分析结果。表（1） 转基因小鼠鉴定引物序列Table 1 The primer sequences specific for the identificationof transgenic miceGenesupstream primer(5-3)downstream primer(5-3)Product sizeMMTV/PyMTGGAAGCAAGTACTTCACAAGGGGGAAAGTCACTAGGAGCAGGG556bpCLCN3TTGCCTACTATCACCACGACGCATCTCCAACCCATTTACT440bp内参CAAATGTTGCTTGCTTGTCTGGTGGTCAGTCGA

14、GTGCACAGTTT200bp1.4 组织免疫荧光检测：石蜡切片常规脱蜡，蒸馏水浸泡2次，每次5min，微波抗原修复，单蒸水洗3次，每次5min。滴加 3% H2O2，室温孵育 15 min，PBS 洗涤 3 次，每次 5 min。滴加即用型5%BSA封闭液，室温孵育40min，弃去封闭液。滴加ClC-3抗体（1:100稀释），湿盒内4过夜。复温40min，PBS洗3次，每次5min，滴加CY3-抗兔/鼠IgG二抗，室温孵育1h，PBS洗5次每次5min，再加入DAPI复染核，PBS洗5次，每次5min。滴加抗荧光猝灭剂封片液，封片，自然晾干。1.5转基因小鼠杂交群体的构建：选取2-3月龄M

15、MTV-PyMT雄性小鼠和CLCN3雌性转基因小鼠进行配对，喂食高压灭菌过的生瓜子，记录其分娩时间。其生育的为F1代杂交鼠，待3周后剪鼠尾提取DNA,PCR鉴定基因型，其中有MMTV-PyMT和CLCN3双转阳性小鼠、MMTV-PyMT单转基因阳性小鼠，也有CLCN3单转阳性小鼠。再选取同窝MMTV-PyMT阳性雄性小鼠和CLCN3阳性雌性转基因小鼠同胞兄妹交配，扩大种群。1.6蛋白印迹分析：分别通过组织匀浆提取同窝MMTV-PyMT单转基因鼠和MMTV/CLCN3双转基因鼠、阴性对照小鼠的肺组织蛋白，然后进行10%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，积层胶70V 30m

16、in，分离胶120V 90min，然后将蛋白转移至PVDF膜上，350mA 90min，转膜结束用5%脱脂奶粉封闭2h。沿Marker70KD处剪开，大于70KD分子量加入ClC-3抗体（1:1000稀释），小于70KD分子量的加入GAPDH单克隆抗体（1:1000稀释），4孵育过夜，回收一抗，TBST洗5次每次5min，分别加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗，室温孵育1h，回收二抗，TBST洗膜5次每次5min，加入发光液，胶片显影曝光。1.7统计方法：实验数据用均数标准误（s）表示。两组数据之间的差异用Students t检验，以P0.05为差异显著。2. 结果2.1 MMTV与C

17、LCN3转基因鼠的培育与鉴定首先用引种的MMTV-PyMT转基因雄鼠和FVB雌鼠进行1:1比例配对（F0代），其生育的小鼠为F1代幼鼠，3周后剪取鼠尾提取DNA，经过加入特异性引物PCR扩增目的基因片段，琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像，准确检测到子代阳性转基因鼠，再选取同窝子代阳性雄鼠和阴性雌鼠进行同胞交配，扩大种群。至今共育子代MMTV-PyMT转基因小鼠共50多只。CLCN3转基因小鼠用同样的方法也进行全同胞交配，至今共培育子代80多只。MMTV-PyMT阳性小鼠在556bp处有明显条带，CLCN3阳性小鼠在440bp处出现条带，200bp为内参基因，部分结果如图1：注：1-7： MMTV-Py

18、MT引物（556bp）。8-11：检测CLCN3引物（440bp）图1 MMTV-PyMT和CLCN3转基因小鼠的鉴定 Note:1-7:identification of MMTV-PyMT:556bp；8-11：identification of CLCN3:440bp Figure 1 Identification of MMTV-PyMT和CLCN3 mice2.2 CLCN3转基因小鼠蛋白表达免疫荧光分析 CLCN3转基因小鼠构建质粒为pLV.EX3d.P/neo-EF1A CLCN3 IRES/eGFP，为了验证CLCN3转基因小鼠是否表达ClC-3蛋白，选取同窝CLCN3单转阳性

19、小鼠和双阴性小鼠处死解剖，取肺，制作石蜡切片，进行组织免疫荧光分析，由于其质粒中携带GFP基因，所以在构建成功的前提下组织中表达绿色荧光蛋白。结果发现CLCN3转基因小鼠在肺组织中（图2A）明显表达ClC-3蛋白和绿色荧光蛋白，而同窝阴性小鼠肺组织（图2B）中仅见支气管上皮细胞少量表达ClC-3。 注：A：CLCN3转基因小鼠的肺组织 B：野生型小鼠的肺组织图2 CLCN3转基因鼠肺组织的ClC-3蛋白表达Note:A： ClC-3 transgenic mice B: wild type mice Figure 2 Immunofluorescence analysis of the ClC

20、-3 expression in lungs 2.3 MMTV-PyMT与CLCN3转基因鼠杂交群体的建立选取2-3月龄MMTV-PyMT阳性雄鼠和CLCN3阳性雌鼠配对（杂交图谱如图3），8周后产仔8-12只，剪取鼠尾提取基因组DNA进行PCR扩增鉴定，若同一只老鼠MMTV-PyMT和CLCN3分别都出现条带，则为双转基因鼠阳性鼠(图1)。共育MMTV-PyMT和CLCN3双转基因杂交子代小鼠约100多只。 图3 MMTV-PyMT与CLCN3转基因小鼠杂交群体建立示意图Figure 3 The establishment of MMTV-PyMT和CLCN3 hybrid strain 2

21、.4 ClC-3蛋白的组织器官的表达分析 为了验证高度转移的乳腺肿瘤和ClC-3蛋白表达之间的关联，选取同一胎的CLCN3单转阳性小鼠、MMTV-PyMT /CLCN3双转阳性小鼠和双阴性小鼠的肺组织，采用组织匀浆法提取蛋白，western-blot方法检测ClC-3蛋白表达水平。结果显示MMTV-PyMT /CLCN3双转阳性小鼠的ClC-3蛋白含量明显高于同窝的MMTV-PyMT单转阳性小鼠（图4）。图4 ClC-3在小鼠肺中的表达Figure 4 Western blot analysis of the ClC-3 expression in lungs3. 讨论 ClC-3属于ClC家

22、族中的一员，推荐名为H+Cl- exchange transporter 3, 基因符号为CLCN3。ClC-3通道蛋白有13个跨膜区域，N和C末端均位于细胞内，其有短型和长型之分，短型ClC-3蛋白由760个氨基酸构成，在短型ClC-3蛋白氨基末端(N端)加上58个氨基酸残基即构成长型ClC-3通道蛋白。广泛分布于脑、肾、肝、骨骼肌、心脏、肾上腺和胰腺等组织。Jentsch TJ和suzuki M表明ClC-3可能作为容积激活性氯离子通道参与调节性细胞容积回缩（RVD）的调节10, 11。RVD被认为是与细胞的增殖、分化、迁移及细胞的凋亡密切相关的生理功能之一。多项研究发现，在肿瘤细胞中，C

23、lC-3可通过调节容积激活性氯离子电流和RVD调控细胞的增殖和迁移过程12-15。提示ClC-3在肿瘤的生长和转移中有重要的作用。 转基因动物技术的发展有30余年的历史。该技术是把目的基因转入早期胚胎细胞,使之能够整合到染色体上,并且传递给子代,这样获得的动物叫转基因动物16 。转基因小鼠已经广泛应用于生命科学、医药基础研究等领域。本研究所应用的ClC-3高表达转基因小鼠采用Gateway技术把目的基因CLCN3克隆到入门载体，不再依赖限制性内切酶而靠载体上存在的特定充足位点和重组酶，高效、快速地把CLCN3克隆到目的载体中。该技术是一种通用性的克隆方法，简单便捷，用于基因的蛋白质表达和功能分

24、析17。ClC-3高表达转基因小鼠质粒名称为pLV.EX3d.P/neo-EF1A CLCN3 IRES/eGFP，稳定克隆到目的载体上，通过胚胎显微注射法得到稳定遗传且高度表达的转基因小鼠，经鼠尾提取基因组DNA、再PCR扩增目的片段，准确快速的检测到CLCN3基因高表达，而且在繁殖的后代中也稳定遗传。因为在质粒中携带GFP基因，所以组织中表达绿色荧光蛋白，所以采用组织免疫荧光的方法对肺组织进行切片观察，发现内源性所携带的绿色荧光蛋白和ClC-3蛋白表达完全一致，表明CLCN3过表达转基因小鼠构建成功。MMTV-PyMT 自发乳腺癌转基因小鼠来源于南京大学模式生物研究所，该小鼠9周自发乳腺肿

25、瘤，12周后出现转移。本研究成功构建了ClC-3高表达的自发乳腺肿瘤小鼠模型，通过PCR技术和组织免疫荧光、Westernblot方法准确进行鉴定，从基因表达水平和组织蛋白表达水平证实所得杂交小鼠成功整合CLCN3和MMTV-PyVT基因，并成功表达ClC-3蛋白，到目前为止培育杂交子代小鼠共100多只。该小鼠模型的成功构建为进一步研究ClC-3在肿瘤生长和转移方面的作用提供了良好的实验基础，同时也为研究ClC-3高表达对其他组织器官生理病理的影响提供实验材料基础。参考文献:1.Cuddapah VA,Sontheimer H.Ion channels and transporters cor

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