MMTV与ClC3转基因鼠杂交品系的建立及鉴定中国试验动物学报.docx

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MMTV与ClC3转基因鼠杂交品系的建立及鉴定中国试验动物学报

CLCN3/MMTV-PyMT转基因小鼠杂交群体的建立及鉴定

邓璐璐1,李琴3,吴慧1,毛建文1，徐彬2

（1,广东药学院基础学院广东广州510006.2,生命科学与生物制药学院广东广州510006.3,贵州省六盘水市人民医院贵州六盘水553001）

摘要

目的：

建立并鉴定CLCN3/MMTV-PyMT双转基因小鼠杂交群体，构建氯通道ClC-3过表达的自发乳腺肿瘤转基因小鼠模型。

方法：

将CLCN3转基因小鼠和MMTV-PyMT转基因小鼠分别进行繁殖，选取阳性子代鼠进行配对，培育杂交后代，然后通过PCR鉴定基因型、通过组织免疫荧光方法、Western-blot检测转基因小鼠蛋白表达情况。

结果：

成功繁育CLCN3转基因小鼠和MMTV-PyMT转基因小鼠，经PCR鉴定成功构建CLCN3/MMTV-PyMT双转基因鼠杂交群体,并成功保种和扩群，经组织免疫荧光和western-blot分析双转基因小鼠的ClC-3蛋白的表达高于MMTV-PyMT转基因小鼠。

结论：

成功构建ClC-3过表达的自发乳腺肿瘤转基因小鼠模型，为进一步研究ClC-3在肿瘤生长和转移中的功能提供了良好的动物模型。

关键词CLCN3;MMTV-PyMT;转基因小鼠;乳腺癌

【中图分类号】Ｒ-332【文献标识码】A

基金项目：

国家自然科学基金项目（31371144）

作者简介：

邓璐璐（1989-）,女,硕士研究生，研究方向：

离子通道转化医学。

E-mail：

luluwenz@

通讯作者：

徐彬。

E-mail：

xubin2003@

EstablishmentandidentificationofClC-3/MMTV-PyMTheterozygousmice

DENGLu-lu1,LIQin3,WUHui1,MAOJian-wen1，XUBin2

（1,SchoolofBasicCourse,Guangzhou510006,China;2,SchoolofBiosciencesandBiopharmaceutics,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China;3,ThePeople’sHospitalofLiupanshuiCity,Liupanshui553001,China）

[Abstract]

ObjectiveToestablishCLCN3/MMTV-PyMTdoubletransgenicmicedevelopedbreasttumorswithsimultaneousoverexpressionofClC-3.

MethodCLCN3transgenicmicewerecrossedwithMMTV-PyMTspontaneousmammarytumormodelmice.ThegenotypewasdeterminedbyPCR.TheexpressionofClC-3intissueswasdetectedbyimmunofluorescenceandwesternblot.ResultsCLCN3andMMTV-PyMTtransgenicmicewerebreedlargelyandCLCN3/MMTV-PyMTheterozygousmicewasestablishsuccessfully.TheClC-3expressioninCLCN3/MMTV-PyMTheterozygousmiceishigherthanMMTV-PyMTmicebyimmunofluorescenceandwesternblotanalysis.ConclusionSpontaneousbreastcancertransgenicmicemodelswithsimultaneousoverexpressionofClC-3wereestablishedsuccessfully.ThedoubletransgenicmiceprovidesagoodanimalmodelforfurtherresearchofClC-3intumorgrowthandmetastasis.

[Keyword]CLCN3;MMTV-PyMT;Transgenicmice;Breastcancer

离子通道如K+,Cl-,和Na+通道的高表达促进了细胞的生长和运动，进一步促进恶性肿瘤细胞的生长和转移,特别是氯离子通道在肿瘤生长和转移中扮演了重要的角色[1]。

ClC氯通道（ClCchloridechannel）是一类电压门控性氯通道，目前在哺乳动物细胞中已发现九种家族成员，其中ClC-3是备受关注的一种。

在乳腺癌组织中、人胶质瘤中氯离子通道ClC-3的表达都明显高于正常组织，并且不同恶性程度之间有明显差异，提示了ClC-3可能在肿瘤发生和发展过程中起了重要作用[2,3]。

近年的研究报道，细胞膜上的ClC-3介导了细胞的premitoticcondensation（PMC）过程，参与细胞周期调控[4,5]。

ZuoW用氯离子通道阻断剂NPPB抑制H2O2激活的氯电流，减少PC12细胞的凋亡，提示与容积调控相关的氯通道ClC-3可能参与肿瘤细胞的凋亡过程[6]。

我们的研究也发现ClC-3在鼻咽癌细胞中作为容积激活性氯离子通道，通过调节容积激活性氯离子电流促进肿瘤细胞的迁移，且发现阻断容积激活性氯离子通道以及下调ClC-3的表达都成功抑制鼻咽癌细胞的迁移，进一步表明了ClC-3与肿瘤细胞迁移密切相关[7-9]。

这些结果从细胞水平上提示ClC-3可能参与肿瘤细胞的细胞周期、细胞凋亡和细胞迁移的调控，但ClC-3在体内肿瘤生长和转移中的作用尚未明确。

因此，内源性过表达ClC-3的转基因小鼠为此方向的研究提供了不可替代的作用。

本研究把CLCN3转基因小鼠和MMTV-PyMT自发性乳腺癌转基因小鼠杂交，构建了内源性ClC-3过表达的自发乳腺肿瘤小鼠模型，为进一步研究ClC-3在肿瘤生长和转移特别是乳腺癌生长和转移方面的研究提供合适的动物模型。

1.材料与方法

1.1实验动物

ClC-3过表达转基因小鼠委托Cyagenbiosciences公司构建，编号为TGS120401AH01.质粒名称为pLV.EX3d.P/neo-EF1A>CLCN3>IRES/eGFP，携带GFP绿色荧光蛋白。

MMTV-PyMT小鼠在南京大学模式动物研究院购买，品系为FVB/N-Tg,634Mul/J，2只雄性MMTV-PyMT转基因小鼠，2只雌性野生型FVB鼠，15-20周龄。

3只雄性，5只雌性，15-20周龄。

SPF环境饲养，每天紫外2小时，温度22-28°，湿度40%-60%,昼夜交替。

1.2实验材料

真空包装饲料、垫料购于广中医动物实验中心，鼠尾试剂盒（CW2094）购于康为世纪有限公司,Taq酶（DRR037S）、DNAMarkerDL1000（D526A）、琼脂糖购自大连宝生物工程有限公司。

小鼠鉴定引物均由上海Invitrogen公司合成（表1）。

免疫染色固定液（P0098）、免疫染色洗涤液（P0106），免疫染色一抗稀释液（P0103）、免疫染色二抗稀释液（P0108），免疫染色抗荧光淬灭封片液（P0126）、AlexaFluor488标记山羊抗兔IG（H+L）（A0423）、GAPDH鼠源一抗（AG019-1）均购于碧云天，ClC-3兔源一抗（ab28736）购于abcam，羊抗鼠二抗（H2311）、羊抗兔二抗（CO211）购于biotechnology公司，蛋白裂解液（K0301）购于thermo公司。

1.3转基因小鼠的整合检测

PCR方法鉴定转基因小鼠基因型。

剪取三周龄小鼠尾尖，采用鼠尾DNA提取试剂盒提取基因组DNA，利用MMTV-PyMT和ClC-3特异性引物（如下表）进行PCR扩增。

PCR体系分别加入PCRMix酶25ul,PCR引物各1ul，模板DNA1ug，ddH2O加到50ul。

反应条件为：

94°预变性3min，94°变性30s，退火64°1min，延伸72°1min，循环35次，72°延伸2min，4°保存。

取10ulPCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统分析结果。

表

（1）转基因小鼠鉴定引物序列

Table1Theprimersequencesspecificfortheidentification

oftransgenicmice

Genes

upstreamprimer（5’-3’）

downstreamprimer（5’-3’）

Productsize

MMTV/PyMT

GGAAGCAAGTACTTCACAAGGG

GGAAAGTCACTAGGAGCAGGG

556bp

CLCN3

TTGCCTACTATCACCACGAC

GCATCTCCAACCCATTTACT

440bp

内参

CAAATGTTGCTTGCTTGTCTGGTG

GTCAGTCGAGTGCACAGTTT

200bp

1.4组织免疫荧光检测：

石蜡切片常规脱蜡，蒸馏水浸泡2次，每次5min，微波抗原修复，单蒸水洗3次，每次5min。

滴加3%H2O2，室温孵育15min，PBS洗涤3次，每次5min。

滴加即用型5%BSA封闭液，室温孵育40min，弃去封闭液。

滴加ClC-3抗体（1:

100稀释），湿盒内4°过夜。

复温40min，PBS洗3次，每次5min，滴加CY3-抗兔/鼠IgG二抗，室温孵育1h，PBS洗5次每次5min，再加入DAPI复染核，PBS洗5次，每次5min。

滴加抗荧光猝灭剂封片液，封片，自然晾干。

1.5转基因小鼠杂交群体的构建：

选取2-3月龄MMTV-PyMT雄性小鼠和CLCN3雌性转基因小鼠进行配对，喂食高压灭菌过的生瓜子，记录其分娩时间。

其生育的为F1代杂交鼠，待3周后剪鼠尾提取DNA,PCR鉴定基因型，其中有MMTV-PyMT和CLCN3双转阳性小鼠、MMTV-PyMT单转基因阳性小鼠，也有CLCN3单转阳性小鼠。

再选取同窝MMTV-PyMT阳性雄性小鼠和CLCN3阳性雌性转基因小鼠同胞兄妹交配，扩大种群。

1.6蛋白印迹分析：

分别通过组织匀浆提取同窝MMTV-PyMT单转基因鼠和MMTV/CLCN3双转基因鼠、阴性对照小鼠的肺组织蛋白，然后进行10%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，积层胶70V30min，分离胶120V90min，然后将蛋白转移至PVDF膜上，350mA90min，转膜结束用5%脱脂奶粉封闭2h。

沿Marker70KD处剪开，大于70KD分子量加入ClC-3抗体（1:

1000稀释），小于70KD分子量的加入GAPDH单克隆抗体（1:

1000稀释），4°孵育过夜，回收一抗，TBST洗5次每次5min，分别加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗，室温孵育1h，回收二抗，TBST洗膜5次每次5min，加入发光液，胶片显影曝光。

1.7统计方法：

实验数据用均数±标准误（

±s）表示。

两组数据之间的差异用Student’st检验，以P﹤0.05为差异显著。

2.结果

2.1MMTV与CLCN3转基因鼠的培育与鉴定

首先用引种的MMTV-PyMT转基因雄鼠和FVB雌鼠进行1:

1比例配对（F0代），其生育的小鼠为F1代幼鼠，3周后剪取鼠尾提取DNA，经过加入特异性引物PCR扩增目的基因片段，琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像，准确检测到子代阳性转基因鼠，再选取同窝子代阳性雄鼠和阴性雌鼠进行同胞交配，扩大种群。

至今共育子代MMTV-PyMT转基因小鼠共50多只。

CLCN3转基因小鼠用同样的方法也进行全同胞交配，至今共培育子代80多只。

MMTV-PyMT阳性小鼠在556bp处有明显条带，CLCN3阳性小鼠在440bp处出现条带，200bp为内参基因，部分结果如图1：

注：

1-7：

MMTV-PyMT引物（556bp）。

8-11：

检测CLCN3引物（440bp）

图1MMTV-PyMT和CLCN3转基因小鼠的鉴定

Note:

1-7:

identificationofMMTV-PyMT:

556bp；8-11：

identificationofCLCN3:

440bp

Figure1IdentificationofMMTV-PyMT和CLCN3mice

2.2CLCN3转基因小鼠蛋白表达免疫荧光分析

CLCN3转基因小鼠构建质粒为pLV.EX3d.P/neo-EF1A>CLCN3>IRES/eGFP，为了验证CLCN3转基因小鼠是否表达ClC-3蛋白，选取同窝CLCN3单转阳性小鼠和双阴性小鼠处死解剖，取肺，制作石蜡切片，进行组织免疫荧光分析，由于其质粒中携带GFP基因，所以在构建成功的前提下组织中表达绿色荧光蛋白。

结果发现CLCN3转基因小鼠在肺组织中（图2A）明显表达ClC-3蛋白和绿色荧光蛋白，而同窝阴性小鼠肺组织（图2B）中仅见支气管上皮细胞少量表达ClC-3。

注：

A：

CLCN3转基因小鼠的肺组织B：

野生型小鼠的肺组织

图2CLCN3转基因鼠肺组织的ClC-3蛋白表达

Note:

A：

ClC-3transgenicmiceB:

wildtypemice

Figure2ImmunofluorescenceanalysisoftheClC-3expressioninlungs

2.3MMTV-PyMT与CLCN3转基因鼠杂交群体的建立

选取2-3月龄MMTV-PyMT阳性雄鼠和CLCN3阳性雌鼠配对（杂交图谱如图3），8周后产仔8-12只，剪取鼠尾提取基因组DNA进行PCR扩增鉴定，若同一只老鼠MMTV-PyMT和CLCN3分别都出现条带，则为双转基因鼠阳性鼠（图1）。

共育MMTV-PyMT和CLCN3双转基因杂交子代小鼠约100多只。

图3MMTV-PyMT与CLCN3转基因小鼠杂交群体建立示意图

Figure3TheestablishmentofMMTV-PyMT和CLCN3hybridstrain

2.4ClC-3蛋白的组织器官的表达分析

为了验证高度转移的乳腺肿瘤和ClC-3蛋白表达之间的关联，选取同一胎的CLCN3单转阳性小鼠、MMTV-PyMT/CLCN3双转阳性小鼠和双阴性小鼠的肺组织，采用组织匀浆法提取蛋白，western-blot方法检测ClC-3蛋白表达水平。

结果显示MMTV-PyMT/CLCN3双转阳性小鼠的ClC-3蛋白含量明显高于同窝的MMTV-PyMT单转阳性小鼠（图4）。

图4ClC-3在小鼠肺中的表达

Figure4WesternblotanalysisoftheClC-3expressioninlungs

3.讨论

ClC-3属于ClC家族中的一员，推荐名为H+／Cl-exchangetransporter3,基因符号为CLCN3。

ClC-3通道蛋白有13个跨膜区域，N和C末端均位于细胞内，其有短型和长型之分，短型ClC-3蛋白由760个氨基酸构成，在短型ClC-3蛋白氨基末端（N端）加上58个氨基酸残基即构成长型ClC-3通道蛋白。

广泛分布于脑、肾、肝、骨骼肌、心脏、肾上腺和胰腺等组织。

JentschTJ和suzukiM表明ClC-3可能作为容积激活性氯离子通道参与调节性细胞容积回缩（RVD）的调节[10,11]。

RVD被认为是与细胞的增殖、分化、迁移及细胞的凋亡密切相关的生理功能之一。

多项研究发现，在肿瘤细胞中，ClC-3可通过调节容积激活性氯离子电流和RVD调控细胞的增殖和迁移过程[12-15]。

提示ClC-3在肿瘤的生长和转移中有重要的作用。

转基因动物技术的发展有30余年的历史。

该技术是把目的基因转入早期胚胎细胞,使之能够整合到染色体上,并且传递给子代,这样获得的动物叫转基因动物[16]。

转基因小鼠已经广泛应用于生命科学、医药基础研究等领域。

本研究所应用的ClC-3高表达转基因小鼠采用Gateway技术把目的基因CLCN3克隆到入门载体，不再依赖限制性内切酶而靠载体上存在的特定充足位点和重组酶，高效、快速地把CLCN3克隆到目的载体中。

该技术是一种通用性的克隆方法，简单便捷，用于基因的蛋白质表达和功能分析[17]。

ClC-3高表达转基因小鼠质粒名称为pLV.EX3d.P/neo-EF1A>CLCN3>IRES/eGFP，稳定克隆到目的载体上，通过胚胎显微注射法得到稳定遗传且高度表达的转基因小鼠，经鼠尾提取基因组DNA、再PCR扩增目的片段，准确快速的检测到CLCN3基因高表达，而且在繁殖的后代中也稳定遗传。

因为在质粒中携带GFP基因，所以组织中表达绿色荧光蛋白，所以采用组织免疫荧光的方法对肺组织进行切片观察，发现内源性所携带的绿色荧光蛋白和ClC-3蛋白表达完全一致，表明CLCN3过表达转基因小鼠构建成功。

MMTV-PyMT自发乳腺癌转基因小鼠来源于南京大学模式生物研究所，该小鼠9周自发乳腺肿瘤，12周后出现转移。

本研究成功构建了ClC-3高表达的自发乳腺肿瘤小鼠模型，通过PCR技术和组织免疫荧光、Westernblot方法准确进行鉴定，从基因表达水平和组织蛋白表达水平证实所得杂交小鼠成功整合CLCN3和MMTV-PyVT基因，并成功表达ClC-3蛋白，到目前为止培育杂交子代小鼠共100多只。

该小鼠模型的成功构建为进一步研究ClC-3在肿瘤生长和转移方面的作用提供了良好的实验基础，同时也为研究ClC-3高表达对其他组织器官生理病理的影响提供实验材料基础。

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