米氏常数测定方法Word格式文档下载.docx

1、1234567TimeTMBV010.5810H2O2163264、实验，密码为 5 个1、打开酶标仪（开关在仪器后部，若仪器没反应，请检查电源是否接通）0，按 Enter 键进入系统。电脑开机，密码为 mby-nano ，双击酶标仪软件图标，出现登录框，直接点 击“登 录”，进入酶标仪 控制界 面选择“铁动力学” （波长为 650nm）板1，若底物为 TMB ，选择模打开电脑内置时钟若 底 物 为 ABTS ， 则 检 验 项 目 选 择 “ gg ”（ 波 长 为 405nm ）新建一个 word 文档，以日期命名，打开。2、加样 ：96 孔板从左至右编号为 1-12，自上而下编号为 A-

2、H 。以 TMB 为例，从第 1 列加样：1从 A1 至 H1 ，每孔加 200L NaAc/HAc Buf ；2从 A1 至 H1 ，每孔加 10L 催化剂（每加一个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反 应体系）；3从 A1 至 H1 ，每孔分别加不同体积（ 0，0.5，1，2，4，6，8，10L）TMB （每加一 个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系） ；4用排枪吸取 32L H2O2加入 A1至 H1，快速放入酶标仪中，点击“读板” ，记下读板 时间（如下表所示，假设第一次读板时间为 09：00： 00）003001：02：03：用排枪加 H2O2时， 注意检查枪头是否插紧 ，否则会

3、导致吸取 H2O2的量不足。亦可先 将 96 孔板放入酶标仪，再加 H2O2，这样可以节约时间。每次读板出来结果后，点击“结果 入库” “是” “确定”，按下“ PrintScreen ”键，点击“退出” ，打开 word 文档， ctrl+V 或者右击选“粘贴” ，保存结果，要留意下次读板的时间。若遗漏某个模板没有保存， 可点击“查询结果” ，下拉框中选择目的模板编号即可。 （现已可以直接拷吸光值读取数据，按 ctrl 键点击该处文字见方法 ）3、第一组数据保存后，将第一组的反应液倒掉，用卷纸将边上的液体擦干。第二、三、 四组同第一组的操作。保存所有数据，拷贝到 U 盘里，整理实验台，关掉酶

4、标仪、空调和 电脑。4、若当天不再继续实验，将 24 孔板中剩余的 H2O2 倒掉，用清洁剂洗后，再用二次水 冲洗一次，放入烘箱中烘干。移液枪放回原处，催化剂、底物和 H2O2 放入冰箱中保存。三、数据处理1、打开 Origin6.1 ，点击右上角的“ Add New Column ”（箭头所指）2、输入数据：命名各列， X 列命名为时间，单位 s， 8 个 Y 列分别为 8 个孔的编号。 X 列时间从 0-180s，0 s对应微孔板编号 1的数据， 30 s对应 code2 的数据，以此类推，将所 读数据输入。点击“ file“ Save Project As”保存文件名为 “第一组”3、数

5、据输入完成后， 选择 X 和 Y 列， 点击左下角的 “点图” 标志（箭头所指）Fit Linear 作 线 性 拟 合在结果对话框里， 拟合的方程为 Y=A+B*X ，B 的值为拟合得出的斜率即反应的初速度 V同样方法得出不同 TMB 体积对应的反应初速度 V ，记录数据：0.007140.009020.011620.014250.015970.015470.017同样方法得出第二、三、四组的反应初速度 V ，记录数据。4、新建 New Project ，数据表 1中命名 X列为底物（ TMB ）浓度，列中数据为 A-H 对应的 孔中 TMB 的物质的量浓度（一般用 moL/L ）；挑选三组

6、比较好的初速度 V ，输入 Y 列选中初速度 V 的三列，右击Statistics on Rows，得出数据表 2，选定 Mean 和 sd 列中的值，右击复制，粘贴至数据表1中选定 X 列、 Mean 列和 sd 列，画点图点击 Analysis Non-linear Curve Fit ，作非线性拟合拟合的方程为米氏方程 y=P1*x/（P2+x） ，y 为反应初速度， x 为底物浓度， P1为 Vmax 值， P2 为米氏常数 Km 值（若软件中没有此方程，可点击 New 新建方程，之后也可点击 Edit可双击 X 或 Y 轴修改坐标轴名称点 击 Start Fiting ， 得 出 对

7、 话 框点击图上方的“ T ”标志5、保存结果。6、计算 Kcat 值Kcat 表示每个酶分子在单位时间内催化底物的分子数，反应了酶催化能力的大小。根 据下面的公式计算：v 的单位为 Ms-1；vmax为非线性拟合得出的值，单位为 s-1；=39000M -1 cm-1；l为反 应体系的高度， 96 孔板每个孔的高度为 1cm，每个孔的容积为 300L，可根据反应体系的 平均体积占 300L 的比例来计算反应体系的高度； E为催化剂的浓度，单位为 M；m 为催 化剂的质量，可根据加入催化剂的体积和催化剂溶液的浓度计算得出； r 为催化剂粒子的半 径，以透射电镜测出的粒径计； 为催化剂的密度，单

8、位为 g/cm-3；N A 为阿伏伽德罗常数， 值为 6.021023； V 为反应体系的平均体积； Kcat 单位为 s-1。附：直接拷数据方法：1. 每次读板后，数据结果入库，待全面测完，按照当天的日期在桌面的 DATA 文件夹中 查找自己的数据， 格式为记事本， 如 20100825.txt ，该文件拷入自带 u 盘。2.选中该记事本文件，右击打开方式，选择用写字板打开，如图打开后如下：3.按 ctrl+A ，将写字板文件中全面数据选中，复制，新建一个 word 文档， 粘贴。4.选中某一列数据：先将鼠标指针放在该列数据的第一个数据前面，然后按住alt 键，向右下方拖动，直到黑色黑色区域将该列数据全面覆盖，注意不要覆盖其他数据，如图：5.选中之后先松开鼠标， 再松开 alt 键，选中后不要点击鼠标 （左右键都不要点） ，按 ctrl+c 复制该列数据。6.打开 origin 软件，选中某列， 按 ctrl+v 即可将该列数据拷入选中列， 如图：7.友情提示：在直接拷取数据时，如遇到不能直接拷入 origin 中时，可在 word 中插入 表格， 选中表格中一行或一列， 将从 txt 中复制的数据粘贴进去， 再在表格中重新选中数据， 复制，即可一一对应的拷入 origin 中的表格中。