米氏常数测定方法Word格式文档下载.docx
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1
2
3
4
5
6
7
Time
TMB
V01
0.5
8
10
H2O2
16
32
64
、实验
，密码为5个
1、打开酶标仪（开关在仪器后部，若仪器没反应，请检查电源是否接通）
0，按Enter键进入系统。
电脑开机，密码为mby-nano，双击酶标仪软件图标
，出
现登录框
，直接点击“登录”，进入酶标仪控制界面
选择“铁动力学”（波长为650nm）
板1
，若底物为TMB，
，选择模
打开
电脑内
置时钟
若底物为ABTS，则检验项目选择“gg”（波长为405nm）
新建一个word文档，以日期命名，打开。
2、加样：
96孔板从左至右编号为1-12，自上而下编号为A-H。
以TMB为例，从第1列加样：
1从A1至H1，每孔加200μLNaAc/HAcBuf；
2从A1至H1，每孔加10μL催化剂（每加一个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系）；
3从A1至H1，每孔分别加不同体积（0，0.5，1，2，4，6，8，10μL）TMB（每加一个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系）；
4用排枪吸取32μLH2O2加入A1至H1，快速放入酶标仪中，点击“读板”，记下读板时间（如下表所示，假设第一次读板时间为09：
00：
00）
00
30
01：
02：
03：
用排枪加H2O2时，注意检查枪头是否插紧，否则会导致吸取H2O2的量不足。
亦可先将96孔板放入酶标仪，再加H2O2，这样可以节约时间。
每次读板出来结果后，点击“结果入库”——>
“是”——>
“确定”，按下“PrintScreen”键，点击“退出”，打开word文档，ctrl+V或者右击选“粘贴”，保存结果，要留意下次读板的时间。
若遗漏某个模板没有保存，可点击“查询结果”，下拉框中选择目的模板编号即可。
（现已可以直接拷吸光值读取数据，
按ctrl键点击该处文字见方法）
3、第一组数据保存后，将第一组的反应液倒掉，用卷纸将边上的液体擦干。
第二、三、四组同第一组的操作。
保存所有数据，拷贝到U盘里，整理实验台，关掉酶标仪、空调和电脑。
4、若当天不再继续实验，将24孔板中剩余的H2O2倒掉，用清洁剂洗后，再用二次水冲洗一次，放入烘箱中烘干。
移液枪放回原处，催化剂、底物和H2O2放入冰箱中保存。
三、数据处理
1、打开Origin6.1，点击右上角的“AddNewColumn”（箭头所指）
2、输入数据：
命名各列，X列命名为时间，单位s，8个Y列分别为8个孔的编号。
X列时间从0-180s，0s对应微孔板编号1的数据，30s对应code2的数据，以此类推，将所读数据输入。
点击“file
—>
“SaveProjectAs”
保存文件名为“第一组”
3、数据输入完成后，选择X和Y列，点击左下角的“点图”标志（箭头所指）
>
FitLinear作线性拟合
在结果对话框里，拟合的方程为Y=A+B*X，B的值为拟合得出的斜率即反应的初速度V
同样方法得出不同TMB体积对应的反应初速度V，记录数据：
0.00714
0.00902
0.01162
0.01425
0.01597
0.01547
0.017
同样方法得出第二、三、四组的反应初速度V，记录数据。
4、新建NewProject，数据表1中命名X列为底物（TMB）浓度，列中数据为A-H对应的孔中TMB的物质的量浓度（一般用μmoL/L）；
挑选三组比较好的初速度V，输入Y列
选中初速度V的三列，右击
StatisticsonRows
，
得出数据表2，选定Mean和sd列中的值，右击复制，粘贴至数据表
1中
选定X列、Mean列和sd列，画点图
点击Analysis—>
Non-linearCurveFit，作非线性拟合
拟合的方程为米氏方程y=P1*x/（P2+x），y为反应初速度，x为底物浓度，P1为Vmax值，P2为米氏常数Km值（若软件中没有此方程，可点击New新建方程，之后也可点击Edit
可双击X或Y轴修改坐标轴名称
点击StartFiting，得出对话框
点击图上方的“T”标志
5、保存结果。
6、计算Kcat值
Kcat表示每个酶分子在单位时间内催化底物的分子数，反应了酶催化能力的大小。
根据下面的公式计算：
v的单位为Ms-1；
vmax为非线性拟合得出的值，单位为s-1；
ε=39000M-1·
cm-1；
l为反应体系的高度，96孔板每个孔的高度为1cm，每个孔的容积为300μL，可根据反应体系的平均体积占300μL的比例来计算反应体系的高度；
[E]为催化剂的浓度，单位为M；
m为催化剂的质量，可根据加入催化剂的体积和催化剂溶液的浓度计算得出；
r为催化剂粒子的半径，以透射电镜测出的粒径计；
ρ为催化剂的密度，单位为g/cm-3；
NA为阿伏伽德罗常数，值为6.02×
1023；
V为反应体系的平均体积；
Kcat单位为s-1。
附：
直接拷数据方法：
1.每次读板后，数据结果入库，待全面测完，按照当天的日期在桌面的DATA文件夹中查找自己的数据，格式为记事本，如20100825.txt，该文件拷入自带u盘。
2.
选中该记事本文件，右击打开方式，选择用写字板打开，如图
打开后如下：
3.
按ctrl+A，将写字板文件中全面数据选中，
复制，新建一个word文档，粘贴。
4.
选中某一列数据：
先将鼠标指针放在该列数据的第一个数据前面，然后按住
alt键，
向右下方拖动，直到黑色黑色区域将该列数据全面覆盖，注意不要覆盖其他数据，如图：
5.选中之后先松开鼠标，再松开alt键，选中后不要点击鼠标（左右键都不要点），按ctrl+c复制该列数据。
6.
打开origin软件，选中某列，按ctrl+v即可将该列数据拷入选中列，如图：
7.友情提示：
在直接拷取数据时，如遇到不能直接拷入origin中时，可在word中插入表格，选中表格中一行或一列，将从txt中复制的数据粘贴进去，再在表格中重新选中数据，复制，即可一一对应的拷入origin中的表格中。
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