DNA指纹图谱技术应用于中药品质鉴定的研究进展文档格式.docx

1、PCR-DGGE法比较分析湖水、猪场地下水四环素耐药基因,发现有相同的四环素耐药基因,且土壤特有菌也含有相同的四环素耐药基因,说明动物粪便中细菌的耐药基因可转移到环境土壤的细菌中,并有可能成为食物链耐药菌的来源。2对减少抗菌药耐药性的思考可以从以下几方面减少动物源细菌耐药性对公共卫生的危害。抗菌药使用量和耐药性监测。耐药性风险评估。研究PK/P D同步模型和防突变浓度（MPC,优化给药方案,减少耐药性产生。PK/P D的研究不仅有利于早期化合物的筛选,而且对评价药物的有效性、推测最佳治疗剂量和用药间隔,使不良反应最小化,以及避免和减少耐药性都有指导性作用。过去对PK/P D的研究主要基于减少药

2、物的不良反应,最近通过优化PK/P D参数以减少耐药性的产生成为关注的焦点,PK/P D同步模型的研究有望成为控制细菌耐药性产生的重要手段。抗生素替代品的开发研究。如益生素（p r obi otics、酶制剂（enzy mes、寡糖（olig osaccharides、矿物质（m inerals、中药（herbs、酸化剂（acidificati on、免疫增强剂等。减少耐药菌通过食物链由动物传递给人。通过执行良好农业规范（G AP,从饲养管理方面减少抗菌药物的使用量,从而减少耐药菌的出现;通过执行良好食品卫生规范（G HP和危害分析关键控制点（HACCP,减少耐药菌在食物链的流通,从而降低人体

3、接触耐药菌的机率。我国动物源病原菌、共栖菌的耐药率较欧美等发达国家高,且有不断上升的趋势,动物性食品分离的沙门氏菌和大肠杆菌多重耐药菌株也占有相当比例。为促进畜牧养殖业持续发展、保障食品安全和维护人类健康,十分有必要在我国开展大规模动物源细菌耐药性调查和食品动物源耐药菌对人类健康影响的风险评估,并在新兽药注册审批时增加相关内容。吴幼,赵秦,张晓瑜,马跃（西南大学荣昌校区动物医学系,重庆402460中图分类号:S85913文献标识码:A文章编号:1000-6354（200801-0024-03中兽医药不仅在临床上对一些疑难病症、慢性病证的治疗具有较好的疗效,而且还克服了在西医治疗中常见而又颇为棘

4、手的药物毒副作用、成瘾性和耐药性等问题,以毒副作用小、疗效独特为世人所称道,正在成为一个增值潜力巨大的产业。中兽医临床和中药产业发展需要优质中药材。而我国传统的中药材鉴定方法（性状鉴定、基原鉴定、显微鉴定及理化鉴定都有其自身的局限性:如性状鉴定是根据中药材的外观性状,基原鉴定是根据其植物学形态特征,显微鉴定是根据其组织、细胞形态以及内含物的特性加以鉴别,这三种鉴定方法都具有较强的主观性;而理化鉴定操作繁琐,并且对含有相同法定标识成分的药材难以鉴别（如黄连和黄柏的法定标识成分均为小檗碱,而且还有大部分中药尚无法定标识成分。这些传统的鉴定标识在生物学上均为物种收稿日期:2007-09-11作者简介

5、:吴幼（1982-,女,在读硕士研究生,研究方向:中兽医学。马跃为通讯作者,E-mail:mayue6399的遗传表现型,不仅受到遗传因素的影响,而且与生物体的生长发育阶段、环境条件,人类活动如引种驯化、加工炮制等有着密切的关系,难免存在主观性强、重复性和稳定性差等缺点。近年来,随着分子生物学技术在中药学领域的渗透与发展,基于DNA分子标记技术的分子鉴定方法成为中药四大鉴定方法的重要补充,得到了不断的发展与应用。1DNA指纹图谱及DNA指纹图谱技术DNA指纹图谱是1985年英国科学家Jeffreys命名的,是基于生物物种或个体的DNA序列特异性,利用分子生物学技术将这种DNA序列特异性通过特异

6、的DNA条带图谱显示出来。目前常用的DNA指纹图谱技术主要有RF LP（限制性内切酶片段长度多态性、RAP D（随机扩增多态性DNA、AP-PCR（任意引物PCR技术、DNA测序法、AF LP（扩增片断长度多态性、I SS R（简单重复序列间区、S C AR（序列特异扩增等。2应用DNA指纹图谱技术研究中药材品质的进展DNA指纹图谱技术比传统的四大鉴别方法更为准确、客中兽医医药杂志J TCVM2008年第1期25综述专论观,适用范围更广,非常适合于近缘种、易混淆品种、珍稀品种、动物药材、破碎药材、陈旧药材、腐烂药材及样品量极为有限的植物模式标本、中药出土标本、古化石标本等珍贵样品的鉴定1。它不

7、仅能区分相近物种（同科、同属不同种,而且可以检测外型极为相似的同种中不同变种、变型、品系、乃至个体之间的DNA 的细微变异。这一技术近年来正越来越广泛地被应用于中药材鉴别,道地药材的鉴定以及动、植物中药种质资源和遗传育种的研究中,并且取得了令人瞩目的成果。2.1应用RF LP 对中药材的品质鉴定日本名古屋市立大学水上元研究小组对日本8个产地野生的柴胡用限制性核酸内切酶D ra 、Kpn 、Taq 酶解进行RFLP 分析,结果发现秋吉台、平尾台、香春、汤布院为代表的山口北九州地理品系的RFLP 与其它品系明显不同,这与形态学、细胞学、化学的研究结果相吻合2。日本千叶大学山崎真已等3采用RFLP

8、方法分析羽扇豆属（L upinus 5种药用植物白羽扇豆（L.a lbus 、黄羽扇豆（L.lu teus 、多叶羽扇豆（L.polyphy llus 、埃及羽扇豆（L.ter m is 、毛羽扇豆（L.h irsu tus 的亲缘关系及与其所含双稠哌啶类生物碱的相关性,结果表明RFLP 可以区别这些羽扇豆属药用植物。RF LP 技术在应用上很不方便,核酸杂交不仅费时费力,而且需要合适的探针并进行放射线标记和显影。同时,与同工酶标记一样,RF LP 分析技术要求新鲜的材料,不适用于干燥中药材的鉴别。2.2应用RAP D 对中药材的鉴别Nakai 等4采用RAPD 和PCR -RFLP 方法对淫

9、羊藿属8种植物进行了DNA 分析,结果发现RAP D 指纹较易区别中国特有种箭叶淫羊藿Epi m ed ium sagittatum （S .et Z .M ax 2i m 和日本其它7种淫羊藿。同时采用叶绿体基因组rbc L （引物间距约 1.4kb 片断扩增后,用Scr F I 酶解进行RFLP 分析,表明日本7种淫羊藿属内变异较大。国内陈林姣等用RAPD 技术鉴别了溪黄草类原植物,认为该方法对药材的“地道性”研究有重要意义5。丁建弥等在比较野山人参和栽培人参的80个引物的RAP D 图谱中,发现一个引物能产生稳定的、可重复的野生山参的特征图谱,可以用来鉴定野山人参6。2.3应用AP -P

10、CR 对中药材的鉴别香港中文大学Cheung 等用AP -PCR 方法成功获得可以区别西洋参Panax quinquefolius L.和人参P .ginseng C .A.M ey 的指纹图谱7曹晖等8,9对菊科地胆草属植物地胆草（Elephantopus scaber 、白花地胆草（E .m ollis 和假地胆草属1种植物假地胆草（Pseudo elephantopus spicatus 以及4种商品苦地胆药材进行AP -PCR 分析,获得了可以用于准确鉴别的DNA 指纹图谱。同时进行DNA 指纹图谱的相似度指数值测定计算分析,证实从福建厦门、台湾高雄、香港和澳门获得的商品药材苦地胆、地

11、胆头、土公英、小本灯竖圬的基原为地胆草。Zhang 等利用AP -PCR 方法对采自不同地区的党参（Codonopsis pilo sula 药材进行分析,表明来自同一地区的党参样品有相似的DNA 指纹图谱,而不同地区的党参样品有不同的DNA 指纹图谱,并说明RAP D 和AP -PCR 可以用于对中药材产地的鉴别10。2.4应用DNA 测序法对中药材的鉴定M izuka m i 比较分析了当归A ngelica acutiloba （Sieb .et Zucc .Kitag .、三岛柴胡B upleurum falcatum acut .sin .non L.和珊瑚菜Glehnia litt

12、oralis Fr .Sch m idt exM iq .的5S r RNA 基因的间隔区的碱基序列,针对该DNA 片断的序列差异,选用限制性内切酶H ind 消化PCR 产物,所获得的图谱可鉴别此3种药材11。王建云等从鸡内金类药材中提取DNA,采用cyt2b 基因PCR 特异扩增,DNA 测序得到约143个碱基的序列片断,其中36个碱基的差异可以明确区分外观十分相似的鸡内金与鸭内金12。王义权等在蛇类药材的cytb 基因片断序列分析基础上,设计了金钱白花蛇PCR 鉴别的一对高特异性引物Bu L -和BuH -,用此引物能在药材粉末中检测出被检样品中是否含有金钱白花蛇13。Hashi m o

13、t o 等14用PCR 方法扩增了鹿茸、蝮蛇和海马的12S r RNA 和cytb 基因片断,并对鹿茸的PCR 产物进行了测序,经电泳检测可达到鉴别的目的,同时还建立了制剂中鹿茸的检测方法。此外,用cyt2b 和12S r RNA 基因序列分析方法鉴定紫河车15、鹿鞭16、龟甲17以及鳖甲18,亦取得成功。对黄芪属26个种19、沙参属10个种20的I TS 序列以及橘属9个种21的重复DNA 序列的分析也已有报道。2.5应用AF LP 对中药材的品质鉴定罗志勇22采用扩增片段长度多态性DNA （AF LP 分子遗传标志技术,分析人参、西洋参基因组DNA 多态性,经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,成

14、功构建出多态性丰富和重复性好的人参、西洋参DNA 指纹图谱。陶莉等23对罗汉果的几个品种进行APF L 标记分析,从中筛选出2个酶组合,建立了一种可用于罗汉果幼苗雌雄鉴别的方法,也为品种的鉴别提供了依据。目前,SC AR 、SS R 和S NP 技术应用于中药材品质鉴定的相关报道还较少。SCAR 通常是与其它分子标记技术结合使用,多用于农作物的基因研究;而SSR 多用于家畜遗传育种,主要包括构建家禽基因图谱、微卫星制作DNA 指纹图、微卫星与生产性状位点的连锁分析及QT L （数量性状定位等方面24;而S NP 主要应用于标记双等位基因,如对猪氟烷基因、ES R （雌激素受体基因的多态性检测等

15、25。3结语中药的产业化发展和走向世界,中药材质量监控是根本。以DNA 分子特征作为遗传标记（genetic marker 构建DNA 指纹图谱进行中药鉴别可以确保中药材的基原真实,从而间接反映中药的整体化学特征及药材质量。非提取中药复方制剂占了中成药产品的绝大多数,而其质量标准的空白是我国中药产业的现代化以及中成药产品走向国际市场的最大障碍。理论上DNA 指纹图谱技术还可以用于对非提取中药复方制剂（如片剂或者散剂产品的质量检测。综合利用上述多种DNA 指纹图谱技术,可以构建非提取中药复方产品直观的DNA 指纹图谱并用作产品的26综述专论质量标准,从而填补我国复方中成药产品缺乏客观、准确的质量

16、标准的空白。因此,在DNA指纹图谱技术用于中药材质量鉴定的研究基础上,急需开展中药复方DNA指纹图谱的研究,以加快我国中成药产业的现代化和国际化进程。参考文献:1徐红,王峥涛,胡之壁.中药DNA分子鉴定技术的发展与应用J.世界科学技术中医药现代化技术,2003（2:24-31.2M izuka m i H,Ohbayashi K,Ohashi H.B upleurum falcatumL.in northern Kyushu and Ya maguchi p refecture are genet2ically distinguished fr om other populati ons,ba

17、sed on DNAfinger p rintsJ.B i ol Phar m Bull,1993,16:729.3Yamazaki M,Sat o A,Sait o K,et al.Molecular phyl ogenybased on RF LP and its relati oin with alkal oid patterns inLup inus p lantsJ.B i ol Phar m Bull,1993,16:1182.4Nakai R,Shoya ma Y,Shirashi S.Genetic characterizati on ofepi m ediu m s peci

18、es using rando m a mp lified poly mor phic d NA（RAP Dand PCR-restricti on frag ment length poly mor phis m（RF LPdiagnosisJ.B i ol Phar m Bull,1996,19:67.5陈林姣,屈良鹊,施苏华,等.RAP D技术在溪黄草类原植物鉴别中的应用J.中国中药杂志,1998,23（6:328.6丁建弥,万树文,梅其春,等.用随机扩增多态DNA（RAP D技术鉴定野山人参J.中成药,2001,23（1:3-5.7Cheung K S,K wan H S,But P H

19、,el a1.Phar macognosticalidentificati on of American and oriental ginseng r oots by ge2nom ic finger p rinting using arbitrarily p ri m er poly merasechain reacti on（AP-PCRJ.J Ethnophar macol,1994,42:67-69.8曹晖,毕培曦,邵鹏柱.中药材苦地胆及其混淆品的PCR鉴别研究J.药学学报,1996,31:543.9曹晖,毕培曦,邵鹏柱.中药材苦地胆的DNA指纹鉴定J.中药材,1996,19:608.

20、10Zhang Y B,Ngan F N,Wang Z T,et al.Rando m p ri m ed poly2merase chain reacti on differentiates Cedonopsis pil osula fr o mdifferent l ocati oniesJ.Planta Medica,1999,65:157.11M izuka m i H.Amp lificati on and sequence of a5S r RNAgene s pacer regi on fr om the crude drug“Angelica Root”J.B i ol Pha

21、r m Bull,1995,18（9:1299-1301.12王建云,王文,宿兵,等.DNA序列分析技术鉴定鸡内金的方法学研究J.中国药科大学学报,1996,27:471.13王义权,周开亚,徐珞珊,等.金钱白花蛇及其伪品的cytb基因序列分析和PCR鉴别研究J.药学学报,1998,33（12:941-947.14Hashi m ot o A,N ishi m ura N,Kokusenya Y,et al.Studies on“Signal”constituents for evaluati on of ani m al crude drugs:app licati on of DNA an

22、alytical technique t o quality eval2uati on of medicines containing ani m al curde drugsJ.NatMed,1998,52（1:38-46.15熊丽娟,王建云,易建文.DNA序列测定鉴定紫河车J.中国药学杂志,1997,32（增刊:41.16王建云,何广新,付文,等.鹿鞭的微量DNA提取及序列鉴定J.中国中药杂志,1997,22:579.17吴平,周开亚,徐珞珊,等.中药材龟甲的分子鉴定研究J.药学学报,1998,33:304.18吴平,周开亚,徐珞珊,等.用聚合酶链反应产物直接测序技术鉴定中药材鳖甲J.中国

23、药科大学学报,1998,29:28.19Wojciechowski M F,Sanders on M J,Baldwin B G,et al.Monophyly of A neuploid A stragalus（Fabaceae:Evidencefr om nuclear ribos omal DNA internal transcribed s pacersequencesJ.Am J Bot,1993,80:711.20葛颂,Schaal B A,洪德元.用核糖体DNA的I TS序列探讨裂叶沙参的系统位置兼论I TS片段在沙参属系统学研究中的价值J.植物分类学报,1997,35:385.

24、21O rf ord S J,Scott N S,Ti m m is J N.A hypervariable m iddlerepetitive DNA sequence fr om C itrusJ.Sp ringer Berlin,1995,91:1248.22罗志勇.AF LP法构建人参、西洋参基因组DNA指纹图谱J.药学学报,2000,35（8:626.23陶莉,王跃进,尤敏.AF LP用于构建罗汉果DNA指纹图谱及其幼苗雌雄鉴别J.武汉植物学研究,2005,23（1:77-80.24王得前,卢立志.微卫星DNA的研究进展J.浙江农业科学,2005（1:1-4.25贾玉艳,陈宏.S NP分子标记的研究及应用J.黄牛杂志 ,2003,29（1:41-45.