DNA指纹图谱技术应用于中药品质鉴定的研究进展文档格式.docx

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PCR-DGGE法比较分析湖水、猪场地下水四环素耐药基因,

发现有相同的四环素耐药基因,且土壤特有菌也含有相同的

四环素耐药基因,说明动物粪便中细菌的耐药基因可转移到

环境土壤的细菌中,并有可能成为食物链耐药菌的来源。

2　对减少抗菌药耐药性的思考

可以从以下几方面减少动物源细菌耐药性对公共卫生

的危害。

①抗菌药使用量和耐药性监测。

②耐药性风险评

估。

③研究PK/PD同步模型和防突变浓度（MPC,优化给

药方案,减少耐药性产生。

PK/PD的研究不仅有利于早期化

合物的筛选,而且对评价药物的有效性、推测最佳治疗剂量

和用药间隔,使不良反应最小化,以及避免和减少耐药性都

有指导性作用。

过去对PK/PD的研究主要基于减少药物的

不良反应,最近通过优化PK/PD参数以减少耐药性的产生

成为关注的焦点,PK/PD同步模型的研究有望成为控制细菌

耐药性产生的重要手段。

④抗生素替代品的开发研究。

如

益生素（probiotics、酶制剂（enzymes、寡糖（oligosaccharides、

矿物质（minerals、中药（herbs、酸化剂（acidification、免疫增

强剂等。

⑤减少耐药菌通过食物链由动物传递给人。

通过执

行良好农业规范（GAP,从饲养管理方面减少抗菌药物的使

用量,从而减少耐药菌的出现;

通过执行良好食品卫生规范

（GHP和危害分析关键控制点（HACCP,减少耐药菌在食物

链的流通,从而降低人体接触耐药菌的机率。

我国动物源病原菌、共栖菌的耐药率较欧美等发达国家

高,且有不断上升的趋势,动物性食品分离的沙门氏菌和大

肠杆菌多重耐药菌株也占有相当比例。

为促进畜牧养殖业

持续发展、保障食品安全和维护人类健康,十分有必要在我

国开展大规模动物源细菌耐药性调查和食品动物源耐药菌

对人类健康影响的风险评估,并在新兽药注册审批时增加相

关内容。

吴　幼,赵　秦,张晓瑜,马　跃

（西南大学荣昌校区动物医学系,重庆　402460

　　中图分类号:

S85913　　　　　　　　文献标识码:

A　　文章编号:

1000-6354（200801-0024-03

　　中兽医药不仅在临床上对一些疑难病症、慢性病证的治

疗具有较好的疗效,而且还克服了在西医治疗中常见而又颇

为棘手的药物毒副作用、成瘾性和耐药性等问题,以毒副作

用小、疗效独特为世人所称道,正在成为一个增值潜力巨大

的产业。

中兽医临床和中药产业发展需要优质中药材。

而

我国传统的中药材鉴定方法（性状鉴定、基原鉴定、显微鉴定

及理化鉴定都有其自身的局限性:

如性状鉴定是根据中药

材的外观性状,基原鉴定是根据其植物学形态特征,显微鉴

定是根据其组织、细胞形态以及内含物的特性加以鉴别,这

三种鉴定方法都具有较强的主观性;

而理化鉴定操作繁琐,

并且对含有相同法定标识成分的药材难以鉴别（如黄连和黄

柏的法定标识成分均为小檗碱,而且还有大部分中药尚无

法定标识成分。

这些传统的鉴定标识在生物学上均为物种

收稿日期:

2007-09-11

作者简介:

吴　幼（1982-,女,在读硕士研究生,研究方向:

中兽医

学。

马跃为通讯作者,E-mail:

mayue6399@

的遗传表现型,不仅受到遗传因素的影响,而且与生物体的

生长发育阶段、环境条件,人类活动如引种驯化、加工炮制等

有着密切的关系,难免存在主观性强、重复性和稳定性差等

缺点。

近年来,随着分子生物学技术在中药学领域的渗透与

发展,基于DNA分子标记技术的分子鉴定方法成为中药四

大鉴定方法的重要补充,得到了不断的发展与应用。

1　DNA指纹图谱及DNA指纹图谱技术

DNA指纹图谱是1985年英国科学家Jeffreys命名的,是

基于生物物种或个体的DNA序列特异性,利用分子生物学技

术将这种DNA序列特异性通过特异的DNA条带图谱显示出

来。

目前常用的DNA指纹图谱技术主要有RFLP（限制性内

切酶片段长度多态性、RAPD（随机扩增多态性DNA、AP-

PCR（任意引物PCR技术、DNA测序法、AFLP（扩增片断长度

多态性、ISSR（简单重复序列间区、SCAR（序列特异扩增等。

2　应用DNA指纹图谱技术研究中药材品质的进展

DNA指纹图谱技术比传统的四大鉴别方法更为准确、客

　中兽医医药杂志　JTCVM

2008年第1期

25　　

综

述专论

观,适用范围更广,非常适合于近缘种、易混淆品种、珍稀品种、动物药材、破碎药材、陈旧药材、腐烂药材及样品量极为有限的植物模式标本、中药出土标本、古化石标本等珍贵样品的鉴定[1]。

它不仅能区分相近物种（同科、同属不同种,而且可以检测外型极为相似的同种中不同变种、变型、品系、乃至个体之间的DNA的细微变异。

这一技术近年来正越来越广泛地被应用于中药材鉴别,道地药材的鉴定以及动、植物中药种质资源和遗传育种的研究中,并且取得了令人瞩目的成果。

2.1　应用RFLP对中药材的品质鉴定

日本名古屋市立大学水上元研究小组对日本8个产地野生的柴胡用限制性核酸内切酶DraⅠ、KpnⅠ、TaqⅠ酶解进行RFLP分析,结果发现秋吉台、平尾台、香春、汤布院为代表的山口北九州地理品系的RFLP与其它品系明显不同,这与形态学、细胞学、化学的研究结果相吻合[2]。

日本千叶大学山崎真已等

[3]

采用RFLP方法分析羽扇豆属（Lupinus

5种药用植物白羽扇豆（L.albus、黄羽扇豆（L.luteus、多

叶羽扇豆（L.polyphyllus、埃及羽扇豆（L.termis、毛羽扇豆（L.hirsutus的亲缘关系及与其所含双稠哌啶类生物碱的相关性,结果表明RFLP可以区别这些羽扇豆属药用植物。

RFLP技术在应用上很不方便,核酸杂交不仅费时费力,

而且需要合适的探针并进行放射线标记和显影。

同时,与同工酶标记一样,RFLP分析技术要求新鲜的材料,不适用于干燥中药材的鉴别。

2.2　应用RAPD对中药材的鉴别

Nakai等

[4]

采用RAPD和PCR-RFLP方法对淫羊藿属

8种植物进行了DNA分析,结果发现RAPD指纹较易区别

中国特有种箭叶淫羊藿Epimediumsagittatum（S.etZ.Max2

im和日本其它7种淫羊藿。

同时采用叶绿体基因组rbcL（引物间距约1.4kb片断扩增后,用ScrFI酶解进行RFLP分析,表明日本7种淫羊藿属内变异较大。

国内陈林

姣等用RAPD技术鉴别了溪黄草类原植物,认为该方法对药材的“地道性”研究有重要意义

[5]

。

丁建弥等在比较野

山人参和栽培人参的80个引物的RAPD图谱中,发现一个引物能产生稳定的、可重复的野生山参的特征图谱,可以用来鉴定野山人参[6]。

2.3　应用AP-PCR对中药材的鉴别

香港中文大学Cheung等用AP-PCR方法成功获得可以区别西洋参PanaxquinquefoliusL.和人参P.ginsengC.A.

Mey的指纹图谱

[7]

曹晖等[8,9]对菊科地胆草属植物地胆草

（Elephantopusscaber、白花地胆草（E.mollis和假地胆草

属1种植物假地胆草（Pseudoelephantopusspicatus以及4种商品苦地胆药材进行AP-PCR分析,获得了可以用于准确鉴别的DNA指纹图谱。

同时进行DNA指纹图谱的相似度指数值测定计算分析,证实从福建厦门、台湾高雄、香港和澳门获得的商品药材苦地胆、地胆头、土公英、小本灯竖圬的基原为地胆草。

Zhang等利用AP-PCR方法对采自不同地区的党参（Codonopsispilosula药材进行分析,表明来自同一地区的党参样品有相似的DNA指纹图谱,而不同地区的党参

样品有不同的DNA指纹图谱,并说明RAPD和AP-PCR可以用于对中药材产地的鉴别[10]。

2.4　应用DNA测序法对中药材的鉴定

Mizukami比较分析了当归Angelicaacutiloba（Sieb.etZucc.Kitag.、三岛柴胡Bupleurumfalcatumacut.sin.nonL.和

珊瑚菜GlehnialittoralisFr.SchmidtexMiq.的5SrRNA基因的间隔区的碱基序列,针对该DNA片断的序列差异,选用限制性内切酶HindⅢ消化PCR产物,所获得的图谱可鉴别此3种药材[11]。

王建云等从鸡内金类药材中提取DNA,采用cyt2b基因PCR特异扩增,DNA测序得到约143个碱基的序列片断,其中36个碱基的差异可以明确区分外观十分相似的鸡内金与鸭内金[12]。

王义权等在蛇类药材的cytb基因片断序列分析基础上,设计了金钱白花蛇PCR鉴别的一对高特异性引物BuL-Ⅰ和BuH-Ⅰ,用此引物能在药材粉末中检测出被检样品中是否含有金钱白花蛇[13]。

Hashimoto等[14]用PCR方法扩增了鹿茸、蝮蛇和海马的12SrRNA和cytb基因片断,并对鹿茸的PCR产物进行了测序,经电泳检测可达到鉴别的目的,同时还建立了制剂中鹿茸的检测方法。

此外,用cyt2b和12SrRNA基因序列分析方法鉴定紫河车

[15]

、鹿鞭[16]、龟甲[17]以及鳖甲[18],亦取得成功。

对黄芪

属26个种[19]、沙参属10个种[20]的ITS序列以及橘属9个种[21]的重复DNA序列的分析也已有报道。

2.5　应用AFLP对中药材的品质鉴定

罗志勇[22]采用扩增片段长度多态性DNA（AFLP分子遗传标志技术,分析人参、西洋参基因组DNA多态性,经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,成功构建出多态性丰富和重复性好的人参、西洋参DNA指纹图谱。

陶莉等[23]对罗汉果的几个品种进行APFL标记分析,从中筛选出2个酶组合,建立了一种可用于罗汉果幼苗雌雄鉴别的方法,也为品种的鉴别提供了依据。

目前,SCAR、SSR和SNP技术应用于中药材品质鉴定的相关报道还较少。

SCAR通常是与其它分子标记技术结合使用,多用于农作物的基因研究;

而SSR多用于家畜遗传育种,主要包括构建家禽基因图谱、微卫星制作DNA指纹图、微卫星与生产性状位点的连锁分析及QTL（数量性状定位等方面[24];

而SNP主要应用于标记双等位基因,如对猪氟烷基

因、ESR（雌激素受体基因的多态性检测等[25]。

3　结语

中药的产业化发展和走向世界,中药材质量监控是根本。

以DNA分子特征作为遗传标记（geneticmarker构建

DNA指纹图谱进行中药鉴别可以确保中药材的基原真实,从

而间接反映中药的整体化学特征及药材质量。

非提取中药复方制剂占了中成药产品的绝大多数,而其质量标准的空白是我国中药产业的现代化以及中成药产品走向国际市场的最大障碍。

理论上DNA指纹图谱技术还可以用于对非提取中药复方制剂（如片剂或者散剂产品的质量检测。

综合利用上述多种DNA指纹图谱技术,可以构建非提取中药复方产品直观的DNA指纹图谱并用作产品的

26　　综述

专论质量标准,从而填补我国复方中成药产品缺乏客观、准确的质

量标准的空白。

因此,在DNA指纹图谱技术用于中药材质量

鉴定的研究基础上,急需开展中药复方DNA指纹图谱的研

究,以加快我国中成药产业的现代化和国际化进程。

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