融合基因筛查SOP.docx

1、融合基因筛查SOPWritten by编制人： 钟维君Date日期:2011-5-13Effective Date生效日期: Distribution Scope发放范围：研发部特检实验室Reviewed by审核者：Approved by批准人：Refer to addendum for document user approval and annual review information 文件使用批准和年度审核信息请参考附录31项融合基因筛查标准操作流程SOP on Fusion Genes of Leukemia检测信息项目名称中文31项融合基因筛查标准操作程序英文SOP on Fus

2、ion Genes of Leukemia检测方法多重PCR反应1. 原理及应用本检测项目利用商品化试剂盒，采用多重PCR方法筛查白血病常见的31种融合基因，可以准确、快速而且可靠地确定白血病的分子类型，提供白血病诊断和治疗的依据。2. 样本要求标准类型EDTA抗凝骨髓/全血2ml收集容器EDTA抗凝管（不含其它物质）运输容器带塑胶盖试管运输要求0-10C冷藏运输小于2天稳定性及储藏要求室温短暂冷藏温度（2-8C）3 天-20C三个月（提取出RNA）-70C一年（提取出RNA cDNA）时间要求无样本拒收及采取措施拒绝重度溶血、严重凝血样本、肝素抗凝影响干扰因素溶血、凝血、脂血、骨髓间质较多或

3、肝素抗凝标本可能会严重影响实验结果其它条件应避免反复冻融标本3. 试剂3.1 订购试剂及试剂盒试剂名称厂家货号试剂型号及规格储藏及稳定性准备工作逆转录试剂盒TOYOBO逆转录酶-20保存；其他4保存逆转录酶4备用，其他室温平衡15分钟KOD PCR试剂盒TOYOBO酶-20保存；其他4保存酶4备用；其他室温平衡15分钟Thunerbird probe QPCR mixTOYOBO-20保存；室温平衡30分钟TAKARA RTAQ PCR试剂盒TAKARA酶-20保存；其他4保存酶4备用；其他室温平衡15分钟Dutp上海生工2mM，4保存室温平衡15分钟UNG酶上海闪晶-20保存；4备用Triz

4、ol Reagentinvitrigen200ml/瓶4保存4备用100 bp DNA ladderTAKARA4保存4备用GELred核酸染料万飞生物RTRT3.2 自备试剂红细胞裂解液；PBS（？）氯仿，异丙醇，75%乙醇，无水乙醇，RNase-free 水3.3 引物配置3.3.1 储存浓度引物（100umol/L）的配制将Takara订购的32条特异性逆转录引物及多重PCR内外侧引物12000rpm/分钟离心1分钟，超净台静默状态下操作，跟据说明书给出的质量nmol数*10ul加入DEPC-H2O，混匀离心，-20保存。3.3.2 工作浓度引物的配制 32条特异性逆转录引物 将储存浓度

5、的32条特异性逆转录引物各取5ul，等量混合，混匀，6000rpm/分钟离心15s，分装，-20保存。 多重PCR初筛引物 按照31种融合基因分组表将融合基因引物分成8组，每组共2管，分内外侧。每管按表中的引物序列号加入储存浓度的多重PCR引物各3ul，内参引物各1.5ul，补水到50ul，工作浓度为6umol/L，混匀离心，分装。-20保存。外侧初筛引物配制表组别筛查引物编号内参引物编号加水量S1111，121，131，141，151，161，171，181011，02123ulS2141，151，231，241，251，261，271，281011，02123ulS3311，011，321

6、，331，341，351，36102127.5ulS4411，421，431，441，461，471011，02129ulS5141，151，531，541，551，561，571011，02126ulS6631，641，651011，02138ulS7711，721，731，741，751011，02132ulS8811，841，851，861，871011，02132ul 内侧初筛引物配制表组别筛查引物编号内参引物编号加水量S1112，122，132，142，152，162，172，182012，02223ulS2142，152，232，242，252，262，272，282012，022

7、23ulS3312，012，322，332，342，352，36202227.5ulS4412，422，432，442，462，472012，02229ulS5142，152，532，542，552，562，572012，02226ulS6632，642，652012，02238ulS7712，722，732，742，752012，02232ulS8812，842，852，862，872012，02232ul. 多重PCR分离引物 按照31种融合基因分组表将融合基因引物分成32组，每组2管，分内外侧。将每一组中储存浓度的融合基因PCR引物各5ul，补水至50ul，工作浓度为10umol/L。混

8、匀离心，分装。-20保存。常规分离实验时，4A、6A、6B、8B、8C共5管融合基因不进行分离。(备注出处) 荧光定量引物探针混合物的配制 将储存浓度的融合基因的引物及探针先配制成工作浓度10umol/L，将每一个融合基因的所有引物和探针按2：1的比例进行混合，备用。4. 仪器设备使用的仪器设备名称型号确认方式普通低速离心机Anke TDLSO-2B自检漩涡震荡仪VWR 分钟ivortexer自检高速冷冻离心机Sigma 3K15自检生物安全柜Biobase自检普通PCR仪BIOER自检荧光定量PCR仪ABI 7300自检5. 质量控制5.1cDNA质量的质控用荧光PCR定量的方法检查样本内参

9、基因ABL，若ABL1.00E+03，样本质量合格；若ABL1.00E+03,则需要稀释RNA后重新逆转录后检测。5.2内标质控多重PCR初筛实验设置管家基因E2A作为内标质控，扩增片段大小671bp，绝大多数标本存在的与表达相关的2个基因：HOX11，212 bp；E2A-MDS，287bp（HOX11和E2A-MDS有什么作用）5.3批内质控荧光定量PCR 每一批检测均需带1个空白对照+1个阳性对照+1个阴性对照。多重PCR初筛实验根据5.2条来判断。多重PCR分离实验根据阳性条带的位置，分别设定阴性对照和空白对照，另设置4D或7C（能否具体写出各种字母代表是什么）阳性的样本做阳性对照，对

10、样本反应体系的除引物以外的试剂进行控制。5.4失控判断规则；5.5失控处理，如发现失控，需及时分析失控原因，必要时上报主管，并协助主管一同进行分析处理，记录处理情况。5.5.2 失控原因分析：失控受多种因素的影响，包括操作失误，试剂配制错误，试剂、质控品的失效，仪器误差等原因。5.5.3 根据失控原因，采取相应措施，重新检测。6. 操作步骤 字体大小6.1有核细胞的分离 1*红细胞裂解液，取混匀后抗凝骨髓或全血0.5ml，混匀。，收集底部的细胞。，若未达到，则重新加入0.5ml混匀后抗凝骨髓或全血，重新裂解。 1*红细胞裂解液，悬浮沉淀细胞，室温裂解5分钟.6.1.7 以3000rpm离心5分

11、钟。，加入1ml 1*PBS重悬沉淀细胞。，即所需细胞团块。6.2提取RNA Reagent，用枪头尖将细胞团块捣碎，加入RNAiso Reagent。 ，可用漩涡振荡器混匀，室温静置 5 分钟。 Reagent 的 1/5 体积量），盖紧离心管盖，用力震荡（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。待充分乳化溶液呈乳粉红状（无分相现象）后，再室温静置 10 分钟。6.2.4 14,000 rpm, 4离心 10分钟。，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液约500ul转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。 6.2.6 向上清

12、中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在 4静置 10 分钟。 6.2.7 14,000 rpm, 4离心 10 分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。 ，将离心管口置于滤纸上吸干，缓慢地沿离心管壁加入 75的DEPC-乙醇 l ml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁。6.2.9 14,000 rpm, 4离心 5分钟后小心倒弃去上清，将离心管口置于滤纸上吸干，缓慢地沿离心管壁加入无水乙醇 l ml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁。 14,000 rpm, 4离心 5分钟后小心倒弃去上清，将离心管口置于滤纸上吸干（为了更好地控制 RNA 中的盐离子含量，应尽量

13、除净乙醇）。 5 分钟（不可以离心或加热干燥，否则 RNA 将会很难溶解），依沉淀量在RNA加水量及浓度记录表记录加入适量的 RNase-free 水溶解沉淀，震荡离心。，并在RNA加水量及浓度记录表记录，使RNA 260A/280A保持在1.7-2.0之间，浓度保持在0.3-0.8ug/ul，若RNA浓度大于0.8ug/ul，则加入RNase-free 水稀释，使其浓度保持在0.3-0.8ug/ul；若RNA浓度小于0.3ug/ul，则在逆转录时，增加RNA模板量，使40ul体系中的加入RNA量2-5ug。 -20保存待用。6.3 逆转录 6.3.1 用TOYOBO逆转录试剂体系，每个样本各

14、逆转录2管，每管40ul体系。6.3.2 体系及反应程序试剂1*(ul)32-N-primer mix2DEPC-H2O7RNA6混匀，离心3-5S,70 *5分钟,4*1分钟,然后加入以下反映混合体系，25ul/管5*RT buffer8Enzyme Mix2DEPC-H2015混匀，离心，37*60分钟,95*5分钟6.4 内参定量及4个常见融合基因的定性检测 荧光定量PCR Thunerbird probe qPCR mix 各融合基因引物探针混合物 ABL BCR-ABL PML-RARA AML1-ETO CBF-MYH11 A型试剂1*（ul）TOYOBO Thunerbird p

15、robe QPCR mix12.5Primer 1(10uM)Mix2.0Primer 2(10uM)Probe(10uM)H2O8.5混匀，离心，分装23ul/管，加入2ul样本cDNA，设置内参ABL标准品做标准曲线，浓度分别为1.0E+07，1.0E+06，1.0E+05，1.0E+04，每个基因设置1个阳性对照，1个阴性对照，1个空白对照。离心，上机。 在ABI 7300软件上编辑样本位置及标曲拷贝数，设置探针荧光集团FAM-TAMRA，内标-NONE95 1min95 10s 60 31s 45cycles在60 * 31s处采集荧光6.5 多重PCR初筛实验 6.5.1 检测方法

16、巢式PCR TOYOBO KOD酶 PCR体系 31种融合基因试剂1*（ul）KOD buffer10KOD酶0.3Dntp(2Mm)4外侧primer mix(6uM)0.5DdH2O4.2CDNA1将上述试剂（除引物和模板）混匀离心，再分装到8个离心管，分别加入相应的外侧primer mix(6uM)，以19ul/管分装到8联管，分别加入对应的CDNA 1ul/管。离心、上机。程序如下：95 5分钟94 30s58 30s 28cycles72 1分钟 72 7分钟 6.5.5 第二次扩增试剂 1*（ul）KOD buffer10KOD酶0.3Dntp(2Mm)4内侧primer mix(

17、6uM)0.5DdH2O4.2第一次扩增产物1将上述试剂（除引物和模板）混匀离心，再分装到8个离心管，分别加入相应的内侧primer mix(6uM)，以19ul/管分装到8联管，分别加入对应的第一次PCR产物 1ul/管。离心、上机。程序如下：95 5分钟94 30s58 30s 28cycles72 1分钟 72 7分钟 6.5.6 电泳 配制1.8-2.0%的1*TAE琼脂糖凝胶，待胶冷却到50-60时按1:20000加入核酸染料GELRED，（100ml加入5ul染料）混合均匀制胶。 在第二次扩增产物加入3-3,5ul的6*loading buffer,混匀，取8ul混合液上样，上样时

18、若样本数2个，每2个样本同组交叉加样，用100 bp DNA ladder做MAKER，恒压100V电泳约35-45分钟，紫外显带，打印分析，根据每组不同的融合基因和不同的产物长度（参考多重PCR融合基因分组及产物长度分析表），挑选出阳性带，分析结果。6.6 多重PCR分离实验6.6.1 检测方法 巢式PCR TAKARA rTAQ酶 PCR体系 阳性组包含的融合基因（参考31种融合基因分组表）及阳性对照、阴性对照、空白对照试剂1*（ul）10*PCR buffer2.5MgCl2(25mM)2Dutp(2mM)0.5外侧分离Primer Mix(10uM)2rTAQ酶0.25UNG酶0.1H

19、2016cDNA2将上述试剂（除引物和模板）混匀离心，以21ul/管分装到8联管，分别加入对应外侧分离primer mix(10uM) 2 ul/管， CDNA 2ul/管。离心、上机。反应程序如下 50 2min 95 5min 94 30s58 30s 28cycle72 1min 72 7min6.6.5 第二次扩增试剂1*（ul）10*PCR buffer2.5MgCl2(25mM)2Dutp(2mM)0.5内侧分离Primer Mix(10uM)2rTAQ酶0.25H2016cDNA2将上述试剂（除引物和模板）混匀离心，以21ul/管分装到8联管，分别加入对应内侧分离primer m

20、ix(10uM) 2 ul/管， 第一次扩增产物 2ul/管。离心、上机。反应程序如下 95 5min 94 30s58 30s 28cycle72 1min 72 7min6.6.6 电泳，待胶冷却到50-60时按1:20000加入核酸染料GELRED，（100ml加入5ul染料）混合均匀制胶。 在第二次扩增产物加入3-3,5ul的6*loading buffer,混匀，取8ul混合液上样，用100 bp DNA ladder做MAKER，恒压100V电泳约35-45分钟，紫外显带，打印分析，根据每组不同的融合基因和不同的产物长度（参考多重PCR融合基因分组及产物长度分析表），挑选出阳性带，

21、分析结果。7. 结果判断7.1荧光定量PCR检测结果分析，融合基因CT值35，结果报告ABL拷贝数及发现XX融合基因。，则将RNA等倍稀释后重新逆转录，还是如此可报告RNA质量差，内参偏低。7.2多重PCR初筛检测结果分析，大多数样本S4，S7组分别可见212bp，287bp的阳性条带。，进行分离试验。，同时又无其他阳性条带，需分析该样本是否失控，结合荧光定量PCR ABL拷贝数，决定是否二次逆转录。 （图中标记）S5阳性，进行分离实验 阴性结果，S4、S7有条带7.3多重PCR分离检测结果分析，阴性对照及空白对照无条带。，根据多重PCR融合基因分组及产物长度分析表和样本的临床诊断分析阳性条带

22、，片段大小及融合基因类型是否符合，同时参考流式及染色体结果，若都符合则报告：检测到XX融合基因。，报告：未检测到常见的31种融合基因。，或片段大小不符，阴性、阳性、空白对照正常，可直接报：未检测到常见的31种融合基因。，但阴性也有条带，需就该融合基因进行单拉实验,进一步分析，是否存在污染。，需分析原因，重新检测。，非特异性扩增，需重新检测。8. 复查标准8.1电泳结果条带个别有缺失的标本需就缺失的部分复查，以确认检测结果的准确性。8.2检测结果与临床不符，或检测结果自相矛盾，需重新检测8.3 7.3中提到的需要重新检测的情况参见实验室检验结果复查的标准操作程序 9. 结果报告 参见SOP-ET

23、003 特检实验室报告审核标准操作程10. 取消检测标准（改为“退检标准”是不是更合适？）10.1样本严重凝血，溶血，无法提取白细胞10.2标本类型不符10.3荧光定量PCR检测内参ABL1000copiers，同时多重PCR初筛实验无任何条带，重复后结果一致11. 方法限制干扰物质，严重溶血，肝素抗凝，反复冻融，灵敏度和特异性（低还是什么影响，能否具体说明怎么影响？）12. 安全须知SOP-LAB010-G实验室消毒标准操作程序 SU0004-G检验工作人员安全防护制度SU0006-G意外事故处理制度13. 相关文件SOP-ET003 特检实验室报告审核标准操作程实验室检验结果复查的标准操作程序多重PCR融合基因分组及产物长度分析表31种融合基因分组表17.相关记录RNA加水量及浓度记录表31项融合基因筛查初筛实验情况记录表31项融合基因筛查分离实验情况记录表