融合基因筛查SOP.docx
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融合基因筛查SOP
Writtenby编制人：
钟维君
Date日期:
2011-5-13
EffectiveDate生效日期:
DistributionScope发放范围：
研发部特检实验室
Reviewedby审核者：
Approvedby批准人：
Refertoaddendumfordocumentuserapprovalandannualreviewinformation
文件使用批准和年度审核信息请参考附录
31项融合基因筛查标准操作流程
SOPonFusionGenesofLeukemia
检测信息
项目名称
中文
31项融合基因筛查标准操作程序
英文
SOPonFusionGenesofLeukemia
检测方法
多重PCR反应
1.原理及应用
本检测项目利用商品化试剂盒，采用多重PCR方法筛查白血病常见的31种融合基因，可以准确、快速而且可靠地确定白血病的分子类型，提供白血病诊断和治疗的依据。
2.样本要求
标准
类型
EDTA抗凝骨髓/全血2ml
收集容器
EDTA抗凝管（不含其它物质）
运输容器
带塑胶盖试管
运输要求
0-10˚C冷藏运输小于2天
稳定性及储藏要求
室温
短暂
冷藏温度（2-8˚C）
3天
-20︒C
三个月（提取出RNA）
-70︒C
一年（提取出RNAcDNA）
时间要求
无
样本拒收及采取措施
拒绝重度溶血、严重凝血样本、肝素抗凝
影响／干扰因素
溶血、凝血、脂血、骨髓间质较多或肝素抗凝标本可能会严重影响实验结果
其它条件
应避免反复冻融标本
3.试剂
3.1订购试剂及试剂盒
试剂名称
厂家
货号
试剂型号及规格
储藏及稳定性
准备工作
逆转录试剂盒
TOYOBO
逆转录酶-20℃保存；
其他4℃保存
逆转录酶4℃备用，其他室温平衡15分钟
KODPCR试剂盒
TOYOBO
酶-20℃保存；
其他4℃保存
酶4℃备用；
其他室温平衡15分钟
ThunerbirdprobeQPCRmix
TOYOBO
-20℃保存；
室温平衡30分钟
TAKARARTAQPCR试剂盒
TAKARA
酶-20℃保存；
其他4℃保存
酶4℃备用；
其他室温平衡15分钟
Dutp
上海生工
2mM，
4℃保存
室温平衡15分钟
UNG酶
上海闪晶
-20℃保存；
4℃备用
TrizolReagent
invitrigen
200ml/瓶
4℃保存
4℃备用
100bpDNAladder
TAKARA
4℃保存
4℃备用
GELred核酸染料
万飞生物
RT
RT
3.2自备试剂
红细胞裂解液；PBS（？
）
氯仿，异丙醇，75%乙醇，无水乙醇，RNase-free水
3.3引物配置
3.3.1储存浓度引物（100umol/L）的配制
将Takara订购的32条特异性逆转录引物及多重PCR内外侧引物12000rpm/分钟离心1分钟，超净台静默状态下操作，跟据说明书给出的质量nmol数*10ul加入DEPC-H2O，混匀离心，-20℃保存。
3.3.2工作浓度引物的配制
32条特异性逆转录引物
将储存浓度的32条特异性逆转录引物各取5ul，等量混合，混匀，6000rpm/分钟离心15s，分装，-20℃保存。
多重PCR初筛引物
按照《31种融合基因分组表》将融合基因引物分成8组，每组共2管，分内外侧。
每管按表中的引物序列号加入储存浓度的多重PCR引物各3ul，内参引物各1.5ul，补水到50ul，工作浓度为6umol/L，混匀离心，分装。
-20℃保存。
外侧初筛引物配制表
组别
筛查引物编号
内参引物编号
加水量
S1
111，121，131，141，151，161，171，181
011，021
23ul
S2
141，151，231，241，251，261，271，281
011，021
23ul
S3
311，011，321，331，341，351，361
021
27.5ul
S4
411，421，431，441，461，471
011，021
29ul
S5
141，151，531，541，551，561，571
011，021
26ul
S6
631，641，651
011，021
38ul
S7
711，721，731，741，751
011，021
32ul
S8
811，841，851，861，871
011，021
32ul
内侧初筛引物配制表
组别
筛查引物编号
内参引物编号
加水量
S1
112，122，132，142，152，162，172，182
012，022
23ul
S2
142，152，232，242，252，262，272，282
012，022
23ul
S3
312，012，322，332，342，352，362
022
27.5ul
S4
412，422，432，442，462，472
012，022
29ul
S5
142，152，532，542，552，562，572
012，022
26ul
S6
632，642，652
012，022
38ul
S7
712，722，732，742，752
012，022
32ul
S8
812，842，852，862，872
012，022
32ul
.多重PCR分离引物
按照《31种融合基因分组表》将融合基因引物分成32组，每组2管，分内外侧。
将每一组中储存浓度的融合基因PCR引物各5ul，补水至50ul，工作浓度为10umol/L。
混匀离心，分装。
-20℃保存。
常规分离实验时，4A、6A、6B、8B、8C共5管融合基因不进行分离。
（备注出处）
荧光定量引物探针混合物的配制
将储存浓度的融合基因的引物及探针先配制成工作浓度10umol/L，将每一个融合基因的所有引物和探针按2：
1的比例进行混合，备用。
4.仪器设备
使用的仪器设备
名称
型号
确认方式
普通低速离心机
AnkeTDLSO-2B
自检
漩涡震荡仪
VWR分钟ivortexer
自检
高速冷冻离心机
Sigma3K15
自检
生物安全柜
Biobase
自检
普通PCR仪
BIOER
自检
荧光定量PCR仪
ABI7300
自检
5.质量控制
5.1cDNA质量的质控
用荧光PCR定量的方法检查样本内参基因ABL，若ABL≥1.00E+03，样本质量合格；若ABL<1.00E+03,则需要稀释RNA后重新逆转录后检测。
5.2内标质控
多重PCR初筛实验设置管家基因E2A作为内标质控，扩增片段大小671bp，绝大多数标本存在的与表达相关的2个基因：
HOX11，212bp；E2A-MDS，287bp（HOX11和E2A-MDS有什么作用）
5.3批内质控
荧光定量PCR每一批检测均需带1个空白对照+1个阳性对照+1个阴性对照。
多重PCR初筛实验根据5.2条来判断。
多重PCR分离实验根据阳性条带的位置，分别设定阴性对照和空白对照，另设置4D或7C（能否具体写出各种字母代表是什么）阳性的样本做阳性对照，对样本反应体系的除引物以外的试剂进行控制。
5.4失控判断规则
；
5.5失控处理
，如发现失控，需及时分析失控原因，必要时上报主管，并协助主管一同进行分析处理，记录处理情况。
5.5.2失控原因分析：
失控受多种因素的影响，包括操作失误，试剂配制错误，试剂、质控品的失效，仪器误差等原因。
5.5.3根据失控原因，采取相应措施，重新检测。
6.操作步骤字体大小
6.1有核细胞的分离
1*红细胞裂解液，取混匀后抗凝骨髓或全血0.5ml，混匀。
，收集底部的细胞。
，若未达到，则重新加入0.5ml混匀后抗凝骨髓或全血，重新裂解。
1*红细胞裂解液，悬浮沉淀细胞，室温裂解5分钟.
6.1.7以3000rpm离心5分钟。
，加入1ml1*PBS重悬沉淀细胞。
，即所需细胞团块。
6.2提取RNA
Reagent，用枪头尖将细胞团块捣碎，加入RNAisoReagent。
，可用漩涡振荡器混匀，室温静置5分钟。
Reagent的1/5体积量），盖紧离心管盖，用力震荡（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。
待充分乳化溶液呈乳粉红状（无分相现象）后，再室温静置10分钟。
6.2.414,000rpm,4℃离心10分钟。
，此时匀浆液分为三层，即：
无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。
吸取上清液约500ul转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。
6.2.6向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在4℃静置10分钟。
6.2.714,000rpm,4℃离心10分钟。
一般在离心后，试管底部会出现沉淀。
，将离心管口置于滤纸上吸干，缓慢地沿离心管壁加入75％的DEPC-乙醇lml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁。
6.2.914,000rpm,4℃离心5分钟后小心倒弃去上清，将离心管口置于滤纸上吸干，缓慢地沿离心管壁加入无水乙醇lml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁。
14,000rpm,4℃离心5分钟后小心倒弃去上清，将离心管口置于滤纸上吸干（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）。
5分钟（不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解），依沉淀量在《RNA加水量及浓度记录表》记录加入适量的RNase-free水溶解沉淀，震荡离心。
，并在《RNA加水量及浓度记录表》记录，使RNA260A/280A保持在1.7-2.0之间，浓度保持在0.3-0.8ug/ul，若RNA浓度大于0.8ug/ul，则加入RNase-free水稀释，使其浓度保持在0.3-0.8ug/ul；若RNA浓度小于0.3ug/ul，则在逆转录时，增加RNA模板量，使40ul体系中的加入RNA量2-5ug。
-20℃保存待用。
6.3逆转录
6.3.1用TOYOBO逆转录试剂体系，每个样本各逆转录2管，每管40ul体系。
6.3.2体系及反应程序
试剂
1*（ul）
32-N-primermix
2
DEPC-H2O
7
RNA
6
混匀，离心3-5S,70℃*5分钟,4℃*1分钟,然后加入以下反映混合体系，25ul/管
5*RTbuffer
8
EnzymeMix
2
DEPC-H20
15
混匀，离心，37℃*60分钟,95℃*5分钟
6.4内参定量及4个常见融合基因的定性检测
荧光定量PCR
ThunerbirdprobeqPCRmix
各融合基因引物探针混合物
ABLBCR-ABLPML-RARAAML1-ETOCBFβ-MYH11A型
试剂
1*（ul）
TOYOBOThunerbirdprobeQPCRmix
12.5
Primer1（10uM）
Mix
2.0
Primer2（10uM）
Probe（10uM）
H2O
8.5
混匀，离心，分装23ul/管，加入2ul样本cDNA，设置内参ABL标准品做标准曲线，浓度分别为1.0E+07，1.0E+06，1.0E+05，1.0E+04，每个基因设置1个阳性对照，1个阴性对照，1个空白对照。
离心，上机。
在ABI7300软件上编辑样本位置及标曲拷贝数，设置探针荧光集团FAM-TAMRA，内标-NONE
95℃1min
95℃10s
60℃31s45cycles
在60℃*31s处采集荧光
6.5多重PCR初筛实验
6.5.1检测方法巢式PCR
TOYOBOKOD酶PCR体系
31种融合基因
试剂
1*（ul）
KODbuffer
10
KOD酶
0.3
Dntp（2Mm）
4
外侧primermix
（6uM）
0.5
DdH2O
4.2
CDNA
1
将上述试剂（除引物和模板）混匀离心，再分装到8个离心管，分别加入相应的外侧primermix（6uM），以19ul/管分装到8联管，分别加入对应的CDNA1ul/管。
离心、上机。
程序如下：
95℃5分钟
94℃30s
58℃30s28cycles
72℃1分钟
72℃7分钟
6.5.5第二次扩增
试剂
1*（ul）
KODbuffer
10
KOD酶
0.3
Dntp（2Mm）
4
内侧primermix
（6uM）
0.5
DdH2O
4.2
第一次扩增产物
1
将上述试剂（除引物和模板）混匀离心，再分装到8个离心管，分别加入相应的内侧primermix（6uM），以19ul/管分装到8联管，分别加入对应的第一次PCR产物1ul/管。
离心、上机。
程序如下：
95℃5分钟
94℃30s
58℃30s28cycles
72℃1分钟
72℃7分钟
6.5.6电泳
配制1.8-2.0%的1*TAE琼脂糖凝胶，待胶冷却到50-60℃时按1:
20000加入核酸染料GELRED，（100ml加入5ul染料）混合均匀制胶。
在第二次扩增产物加入3-3,5ul的6*loadingbuffer,混匀，取8ul混合液上样，上样时若样本数≥2个，每2个样本同组交叉加样，用100bpDNAladder做MAKER，恒压100V电泳约35-45分钟，紫外显带，打印分析，根据每组不同的融合基因和不同的产物长度（参考《多重PCR融合基因分组及产物长度分析表》），挑选出阳性带，分析结果。
6.6多重PCR分离实验
6.6.1检测方法巢式PCR
TAKARArTAQ酶PCR体系
阳性组包含的融合基因（参考《31种融合基因分组表》）及阳性对照、阴性对照、空白对照
试剂
1*（ul）
10*PCRbuffer
2.5
MgCl2（25mM）
2
Dutp（2mM）
0.5
外侧分离PrimerMix（10uM）
2
rTAQ酶
0.25
UNG酶
0.1
H20
16
cDNA
2
将上述试剂（除引物和模板）混匀离心，以21ul/管分装到8联管，分别加入对应外侧分离primermix（10uM）2ul/管，CDNA2ul/管。
离心、上机。
反应程序如下
50℃2min
95℃5min
94℃30s
58℃30s28cycle
72℃1min
72℃7min
6.6.5第二次扩增
试剂
1*（ul）
10*PCRbuffer
2.5
MgCl2（25mM）
2
Dutp（2mM）
0.5
内侧分离PrimerMix（10uM）
2
rTAQ酶
0.25
H20
16
cDNA
2
将上述试剂（除引物和模板）混匀离心，以21ul/管分装到8联管，分别加入对应内侧分离primermix（10uM）2ul/管，第一次扩增产物2ul/管。
离心、上机。
反应程序如下
95℃5min
94℃30s
58℃30s28cycle
72℃1min
72℃7min
6.6.6电泳
，待胶冷却到50-60℃时按1:
20000加入核酸染料GELRED，（100ml加入5ul染料）混合均匀制胶。
在第二次扩增产物加入3-3,5ul的6*loadingbuffer,混匀，取8ul混合液上样，用100bpDNAladder做MAKER，恒压100V电泳约35-45分钟，紫外显带，打印分析，根据每组不同的融合基因和不同的产物长度（参考《多重PCR融合基因分组及产物长度分析表》），挑选出阳性带，分析结果。
7.结果判断
7.1荧光定量PCR检测结果分析
，融合基因CT值<35，结果报告ABL拷贝数及发现XX融合基因。
，则将RNA等倍稀释后重新逆转录，还是如此可报告RNA质量差，内参偏低。
7.2多重PCR初筛检测结果分析
，大多数样本S4，S7组分别可见212bp，287bp的阳性条带。
，进行分离试验。
，同时又无其他阳性条带，需分析该样本是否失控，结合荧光定量PCRABL拷贝数，决定是否二次逆转录。
（图中标记）
S5阳性，进行分离实验阴性结果，S4、S7有条带
7.3多重PCR分离检测结果分析
，阴性对照及空白对照无条带。
，根据《多重PCR融合基因分组及产物长度分析表》和样本的临床诊断分析阳性条带，片段大小及融合基因类型是否符合，同时参考流式及染色体结果，若都符合则报告：
检测到XX融合基因。
，报告：
未检测到常见的31种融合基因。
，或片段大小不符，阴性、阳性、空白对照正常，可直接报：
未检测到常见的31种融合基因。
，但阴性也有条带，需就该融合基因进行单拉实验,进一步分析，是否存在污染。
，需分析原因，重新检测。
，非特异性扩增，需重新检测。
8.复查标准
8.1电泳结果条带个别有缺失的标本需就缺失的部分复查，以确认检测结果的准确性。
8.2检测结果与临床不符，或检测结果自相矛盾，需重新检测
8.37.3中提到的需要重新检测的情况
参见《实验室检验结果复查的标准操作程序》
9.结果报告
参见《SOP-ET003特检实验室报告审核标准操作程》
10.取消检测标准（改为“退检标准”是不是更合适？
）
10.1样本严重凝血，溶血，无法提取白细胞
10.2标本类型不符
10.3荧光定量PCR检测内参ABL<1000copiers，同时多重PCR初筛实验无任何条带，重复后结果一致
11.方法限制
干扰物质，严重溶血，肝素抗凝，反复冻融，灵敏度和特异性（低还是什么影响，能否具体说明怎么影响？
）
12.安全须知
SOP-LAB010-G《实验室消毒标准操作程序》
SU0004-G《检验工作人员安全防护制度》
SU0006-G《意外事故处理制度》
13.相关文件
SOP-ET003特检实验室报告审核标准操作程
实验室检验结果复查的标准操作程序
多重PCR融合基因分组及产物长度分析表
31种融合基因分组表
17.相关记录
《RNA加水量及浓度记录表》
《31项融合基因筛查初筛实验情况记录表》
《31项融合基因筛查分离实验情况记录表》
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