刺五加对脑出血大鼠细胞凋亡的影响文档格式.docx

1、Bcl 2；Bax【Abstract】 Objective To observe the effects of Acanthopanax senticosus （AS） on brain apoptosis and expression of Bcl 2, Bax protein in rats after intracerebral hemorrhage （ICH） and explore the protective mechanism of AS on neural cell. Methods Male Wistar rats were divided randomly into nor

2、mal, model, sham operated and therapy groups. The therapy group included high and low dose AS therapy groups. Models of ICH were established on local injection of collagenase into caudate nucleus. The therapy group rats were treated with AS. Rats of all groups were killed at specific times and apopt

3、osis level and the change of Bcl 2, Bax were detected. Results Apoptosis cells in therapy group were significantly decreased compared with that of model group at 12 h, 1, 3 and 7 d （P0.01, P0.05）. The expression of Bcl 2 protein in therapy group were significantly increased compared with that of mod

4、el group at 12 h, 1, 3 and 7 d （P0.01, P0.05）. The expression of Bax protein in therapy group were significantly increased compared with that of model group at 12 h, 1, 3 and 7 d （P0.01, P0.05）. Conclusions AS could greatly reduce the amount of apoptosis cells after ICH，which probably relates to hig

5、h expression of Bcl 2 protein and lower expression of Bax protein. 【Key words】 Intracerebral hemorrhage; Acanthopanax senticosus; Apoptosis; TUNEL; Bcl 2; Bax脑出血（ICH）后血肿周围组织继发性损伤机制研究为临床药物干预治疗ICH提供了科学依据。刺五加（AS）对缺血性脑损伤的治疗作用已被临床与动物实验所证实，对于出血性脑血管病，临床上也已广泛应用。AS治疗ICH机制，目前尚不完全清楚。本实验旨在观察ICH后血肿周围组织神经细胞凋亡和Bcl

6、 2、Bax蛋白表达基础上，采用AS干预治疗，探讨AS对其影响及脑保护作用。1 材料与方法1.1 实验材料健康Wistar大鼠126只，雄性，体重250300 g，由中国人民解放军第三军医大学大坪医院动物中心提供；原位末端标记法（TUNEL）试剂盒购于美国Roche公司；型胶原酶（1.5 kU/支）购于美国Sigma公司；兔抗大鼠Bcl 2、Bax单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）显色剂均购于北京博奥森生物工程有限公司；AS注射液（20 ml/支,批号2）由黑龙江完达山制药厂生产。1.2 实验方法1.2.1 动物模型制作参照Rosenberg的大鼠ICH模型制作方法1，实验

7、大鼠禁饮食12 h之后，以10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉，俯卧位固定于立体定位仪上。局部消毒后“丁”字形剪开颅顶皮肤，按照大鼠脑立体定位图谱2定位尾状核，前囟为0点，向右旁开3 mm,向前0.2 mm，牙科钻钻透颅骨，钻孔直径0.8 mm，微量注射器针头垂直刺入脑组织，进针5.5 mm（右侧尾状核所在部位）。向大鼠的右侧尾状核缓慢注入0.5 l（1 U）胶原酶，留针10 min后缓慢拔出穿刺针，缝合皮肤，予局部消毒。假手术组以等量生理盐水代替胶原酶注入右侧尾状核。动物苏醒后，放回笼内饲养，正常进食进水，室温37左右。1.2.2 大鼠选入标准根据Bederson神经缺损体

8、征评分法3进行综合等级评分。缺损体征达3级及以上者为制模成功。断头取脑后沿进针道切开可见明显血肿。不符合条件的大鼠弃去，重新补充。1.2.3 大鼠分组与给药 随机将大鼠分为5组。正常组：大鼠6只,普通饲养，不作任何处理，饲养1 w后断头取脑制作标本。假手术组：大鼠30只，普通饲养，术后3 h以2 ml生理盐水腹腔注射，以后每日1次，直到处死为止。模型组：大鼠30只，制作ICH模型（见上述）术后处理同假手术组。AS小剂量组：制模成功后，每日给予AS注射液，6.25 ml/kg体重，加生理盐水至2 ml，每日1次腹腔注射。AS大剂量组：制模成功后，每日给予AS注射液31.25 ml/kg体重，分2

9、次腹腔注射，二次注射间隔8 h以上，直到处死为止。除正常组外分别在术后6、12 h、1、3、7 d断头取脑制作标本，每个时间点观察6只大鼠。1.2.4 组织取材在相应的时间点用水合氯醛麻醉大鼠，开胸，左心室插管灌注，右心耳剪开引流。先灌注生理盐水150 ml,再以4%多聚甲醛灌注至大鼠发白僵硬，然后快速断头取脑。沿穿刺针道冠状面自上向下切开至尾状核处，可见血肿灶。以穿刺点为中心，冠状面取厚度5 mm脑组织置于4%多聚甲醛液中固定4 h，脱水后石蜡包埋。以血肿灶为中心制作水平位脑组织切片，切片厚度4 m做苏木素 伊红（HE）染色和免疫组织化学染色。1.3 检测方法1.3.1 HE染色方法观察组织

10、病理学变化切片经梯度酒精水化、HE染色、封片等程序处理后，在光学显微镜下观察血肿周围组织病理变化。1.3.2 血肿周围组织细胞凋亡水平 TUNEL染色法检测细胞凋亡。切片经过氧化氢、复合消化液处理，加末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），37孵育1 h,用链霉亲和素孵育，DAB显色，HE复染。对照组以磷酸盐缓冲液（PBS）代替人末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）。阳性细胞核呈棕黄色颗粒状。高倍光镜下（400倍）计算凋亡指数（AI）,即每张片选取不重叠10个细胞数最多的高倍视野，计算每个视野中凋亡细胞与总细胞数的百分比和10个视野的平均凋亡细胞百分数，再计算每个时间点（6张切片）平均凋亡细胞百分数。1.3

11、.3 血肿周围组织Bcl 2与Bax的表达检测采用SP方法，加1200兔抗大鼠Bcl 2、Bax一抗，经过二抗处理，链霉亲和素孵育，DAB显色，HE复染。Bcl 2与Bax阳性细胞胞浆呈棕黄色染色。计算每个时间点（6张切片）平均阳性细胞数，方法同前述。1.4 统计学处理采用SPSS13.0统计学处理软件，数据采用xs表示。经过方差齐性检验后，组间两两比较采用单因素方差分析。2 结果2.1 病理形态学结果HE染色400倍切片中，可观察到血肿周围部分细胞体积缩小，细胞核浓染，细胞核染色质聚集于细胞核一侧呈新月形，并大小不等的核碎片，见图1。2.2 AS对血肿周围组织细胞凋亡的影响凋亡细胞在TUNE

12、L染色下胞核呈棕褐色。正常组和假手术组仅有少量凋亡细胞，两组比较差异不明显（P0.05）；模型组、 AS小剂量组与AS大剂量组，6 h凋亡细胞数即明显高于假手术组，1 d达高峰，之后逐渐下降，但至7 d仍较假手术组显著增高（P0.01）；AS小剂量组与模型组比较，凋亡细胞数于12 h减少（P0.05），1、3、7 d明显减少（P0.01）；AS大剂量组与模型组比较，凋亡细胞数于12 h、1 d、3 d、7 d明显减少（P0.01）；AS大剂量组与AS小剂量组相比，凋亡细胞数于1、3 d减少（P0.05），7 d明显减少（P0.01）。见图1和表1。表1 AS对大鼠ICH后细胞凋亡的影响（略）2

13、.3 AS对血肿周围组织Bcl 2表达的影响Bcl 2阳性细胞SP染色时胞浆呈棕褐色，主要表达于大脑皮质与基底节区。Bcl 2表达水平：假手术组各时间点与正常组对比无显著差异（P0.05）；模型组、AS小剂量组与AS大剂量组6 h时即有表达，12 h时达高峰，之后逐渐下降，7 d仍有相对较高表达。三组之间差异明显。模型组各时间点均明显高于假手术组（P0.01）；AS小剂量组12 h表达高于模型组（P0.05），1、3、7 d表达明显高于模型组（P0.01）；AS大剂量组于12 h、1d时表达较AS小剂量组增高（P0.05），3、7 d表达明显高于AS小剂量组（P0.01）。见图1和表2。表2

14、AS对大鼠ICH后Bcl 2的影响（略）2.4 AS对血肿周围组织Bax表达的影响Bax主要表达于血肿周围区，阳性表达细胞SP染色胞浆呈棕褐色。假手术组与正常组很少表达，两组无显著差异（P0.05）；模型组、AS小剂量组与AS大剂量组6 h时较少表达，12 h时开始增加，1 d达高峰，3 d明显下降，7 d仍有表达，三组间有明显差异。模型组于各时间点均较假手术组明显增加（P0.01）；AS小剂量组表达于12 h低于模型组（P0.05），1、3、7 d明显低于模型组（P0.01）；AS大剂量组于12 h、1 d、3 d低于AS小剂量组（P0.05），7 d明显低于AS小剂量组（P0.01）。见图

15、1和表3。表3 AS对大鼠ICH后Bax的影响（略）3 讨论细胞凋亡是由多基因调控的细胞程序性死亡过程，是一种基本生命现象，具有维持机体正常生理过程和多细胞生物正常发育成熟的作用。细胞凋亡受到机体的严密调控，其过程是瀑布式基因表达过程，许多基因参与这一过程。其中包括Bcl 2基因家族。该基因家族可分抗凋亡（Bcl 2、Bcl XL等）和促凋亡（bax、bad、bid等）两大亚族。由Bcl 2基因表达的Bcl 2蛋白是一种膜合蛋白，包括分子量各为26 kD的Bcl 2和21 kD的Bcl 2两种相似蛋白，存在于细胞的线粒体、核膜、内质网膜等处，主要功能是抑制细胞凋亡、延长细胞寿命。作用机制与抑制

16、氧自由基产生、抑制Ca2+释放、阻止半胱氨酸蛋白酶 3（Caspase 3）激活、抑制Bax蛋白的促凋亡作用以及抑制细胞色素C释放等方面有关。Bax蛋白是Bcl 2的同源蛋白，同样存在于线粒体外膜、内质网膜和核被膜的细胞质面，能够增加线粒体膜通透性，使细胞色素C释放至细胞质并与衔接蛋白即凋亡蛋白激活因子（Apaf 1）结合，促进Caspase级联反应，导致细胞死亡。Bax还通过与Bcl 2蛋白结合形成异二聚体，使Bcl 2失去抑制细胞凋亡的作用。正常细胞中，存在Bax与Bcl 2微量表达，细胞是否发生凋亡，依赖于Bcl 2/Bax的比例4。研究5表明,细胞凋亡是ICH后脑组织损伤的主要原因。I

17、CH后神经细胞死亡分为坏死和凋亡。坏死以神经细胞肿胀和溶解为特征,包括群体细胞死亡和继发炎症反应。凋亡则以细胞核皱缩形成凋亡小体为特征。血肿压迫、血肿局部血流量下降、自由基大量产生、炎症反应6、凝血酶7及血液成分如血红蛋白等因素均可诱发或加重细胞凋亡。细胞凋亡可以被外界因素如药物、低温等中止，因而抑制细胞凋亡可促进神经功能恢复。本实验通过应用AS干预大鼠 ICH模型，观察其对ICH后凋亡细胞的影响。AS注射液是一种中药制剂，系AS茎叶精制而成的无菌水溶液。主要化学成分为异嗪皮定、 谷甾醇、异秦皮定甙、紫丁香树酯醇甙等。根据祖国医学，AS具有补肾安神、益气固本、活血通络、强身延年之功效。近年来临

18、床应用AS注射液治疗ICH取得明显效果8，但其治疗机制仍待深入探讨。本实验显示,细胞凋亡伴随ICH而大量产生。但治疗组12 h、1、3、7 d凋亡细胞数明显低于模型组，且大剂量组疗效明显优于小剂量组。表明AS可明显对抗ICH神经细胞凋亡。其机制可能为：AS具有清除氧自由基，升高超氧化物歧化酶（SOD）活力，降低过氧化脂质LPO）作用9；扩张脑血管，增加血肿周围局部血流量10。可减轻脑水肿，改善微循环，降低血黏度，抑制血小板聚集；具有抗炎作用11，12，抑制炎症因子对血肿周围组织的损伤。减少炎症因子产生，从而降低了某些炎症因子参与的细胞凋亡过程。Bax于ICH后6 h即有表达，1 d达高峰，表明

19、Bax表达高峰期与细胞凋亡一致，显示其与细胞凋亡一致性。Bcl 2在ICH后12 h达高峰，表达高峰较Bax提前，此可能与ICH损伤诱发细胞的保护机制激活有关。ICH时,血肿的占位导致血肿周围组织血流量下降,局部缺血缺氧,产生大量自由基和其他细胞因子13，诱发细胞凋亡。AS通过Bcl 2表达升高阻止以上因素所诱导的细胞凋亡,发挥抗凋亡作用。ICH后细胞凋亡和Bcl 2、Bax的表达均呈现规律性的变化，从6 h至7 d，ICH后Bcl 2与Bax表达均明显高于正常组与对照组，显示在细胞凋亡调控过程中，各种因子之间的相互拮抗作用。AS干预后于12 h、1、3、7 d可明显提高Bcl 2表达，于12

20、 h、1、3 d可降低Bax表达，大剂量组尤为明显。提示AS可能通过升高Bcl 2表达，降低Bax表达而抑制细胞凋亡，从而发挥脑保护作用。【参考文献】 1 Rosenberg GA,Mun Bryce S,Wesley M,et al.Collagenase induced intracerebral hemorrhage in ratsJ.Stroke，1990；21（5）:801 7.2 诸葛启训主译.George Paxinos，Charles Watson著.大鼠脑立体定位图谱M.北京：人民卫生出版社，2005：6.3 Peeling J，Yan HJ,Chen SG,et al.Pr

21、otective effects of free radical inhibitors in intracerebral hemorrhage in ratJ.Brain Res，1998；795（1 2）:63 70.4 Matsushita K,Meng W,Wang X,et al.Evidence for apoptosis after intebcerebral hemorrhage in rat striatumJ.J Cereb Blood Flow Metab，2000；20（2）:369 404.5 Qureshi I,Suri MF,Ostrow PT,et al.Apop

22、tosis as a form of cell death in intracerebral hemorrhageJ.Neurosurgery，2003；52（5）:1041 7.6 Mayer SA，Lignelli A，Fink ME,et al.Perilesional blood flow and edema formation in acute intracerebral hemorrhage:a SPECT studyJ.Stroke,1998；29（9）:1791 8.7 Xi G，Keep RF，Hua Y,et al.Attenuation of thrombin induc

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24、in postmenopausal womenJ.Biochem Biophys Res Commun，2008；375（1）：44 8.10 白树风，杨建学.刺五加注射液对脑出血血肿及周围水肿带的治疗作用J.临床荟萃，2002；17（2）：97 8.11 陈博.刺五加对重症急性胰腺炎肺损伤大鼠核转录因子 HB的影响J.中国当代医药，2010；17（7）：13 4.12 戎爱群，江年.复方刺五加对小鼠免疫功能的影响J.中成药，2009；31（10）：1628 9.13 胡利华，吴江，杜丹华，等.实验性脑出血急性期灶周组织水肿及炎性因子的表达J.中风与神经疾病杂志，2006；23（5）：552 4.