刺五加对脑出血大鼠细胞凋亡的影响文档格式.docx
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Bcl2；
Bax
【Abstract】ObjectiveToobservetheeffectsofAcanthopanaxsenticosus（AS）onbrainapoptosisandexpressionofBcl2,Baxproteininratsafterintracerebralhemorrhage（ICH）andexploretheprotectivemechanismofASonneuralcell.MethodsMaleWistarratsweredividedrandomlyintonormal,model,shamoperatedandtherapygroups.ThetherapygroupincludedhighandlowdoseAStherapygroups.ModelsofICHwereestablishedonlocalinjectionofcollagenaseintocaudatenucleus.ThetherapygroupratsweretreatedwithAS.RatsofallgroupswerekilledatspecifictimesandapoptosislevelandthechangeofBcl2,Baxweredetected.ResultsApoptosiscellsintherapygroupweresignificantlydecreasedcom
paredwiththatofmodelgroupat12h,1,3and7d（P＜0.01,P＜0.05）.TheexpressionofBcl2proteinintherapygroupweresignificantlyincreasedcomparedwiththatofmodelgroupat12h,1,3and7d（P＜0.01,P＜0.05）.Theexpressio
nofBaxproteinintherapygroupweresignificantlyincreasedcomparedwiththatofmodelgroupat12h,1,3and7d（P＜0.01,P＜0.05）.ConclusionsAScouldgreatlyreducetheamountofapoptosiscellsafterICH，whichprobablyrelatestohighexpressionofBcl2proteinandlowerexpressionofBaxprotein.
【Keywords】Intracerebralhemorrhage;
Acanthopanaxsenticosus;
Apoptosis;
TUNEL;
Bcl2;
Bax
脑出血（ICH）后血肿周围组织继发性损伤机制研究为临床药物干预治疗ICH提供了科学依据。
刺五加（AS）对缺血性脑损伤的治疗作用已被临床与动物实验所证实，对于出血性脑血管病，临床上也已广泛应用。
AS治疗ICH机制，目前尚不完全清楚。
本实验旨在观察ICH后血肿周围组织神经细胞凋亡和Bcl2、Bax蛋白表达基础上，采用AS干预治疗，探讨AS对其影响及脑保护作用。
1材料与方法
1.1实验材料
健康Wistar大鼠126只，雄性，体重250～300g，由中国人民解放军第三军医大学大坪医院动物中心提供；
原位末端标记法（TUNEL）试剂盒购于美国Roche公司；
Ⅶ型胶原酶（1.5kU/支）购于美国Sigma公司；
兔抗大鼠Bcl2、Bax单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）显色剂均购于北京博奥森生物工程有限公司；
AS注射液（20ml/支,批号2）由黑龙江完达山制药厂生产。
1.2实验方法
1.2.1动物模型制作
参照Rosenberg的大鼠ICH模型制作方法〔1〕，实验大鼠禁饮食12h之后，以10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉，俯卧位固定于立体定位仪上。
局部消毒后“丁”字形剪开颅顶皮肤，按照《大鼠脑立体定位图谱》〔2〕定位尾状核，前囟为0点，向右旁开3mm,向前0.2mm，牙科钻钻透颅骨，钻孔直径0.8mm，微量注射器针头垂直刺入脑组织，进针5.5mm（右侧尾状核所在部位）。
向大鼠的右侧尾状核缓慢注入0
.5μl（1U）胶原酶，留针10min后缓慢拔出穿刺针，缝合皮肤，予局部消毒。
假手术组以等量生理盐水代替胶原酶注入右侧尾状核。
动物苏醒后，放回笼内饲养，正常进食进水，室温37℃左右。
1.2.2大鼠选入标准
根据Bederson神经缺损体征评分法〔3〕进行综合等级评分。
缺损体征达3级及以上者为制模成功。
断头取脑后沿进针道切开可见明显血肿。
不符合条件的大鼠弃去，重新补充。
1.2.3大鼠分组与给药随机将大鼠分为5组。
①正常组：
大鼠6只,普通饲养，不作任何处理，饲养1w后断头取脑制作标本。
②假手术组：
大鼠30只，普通饲养，术后3h以2ml生理盐水腹腔注射，以后每日1次，直到处死为止。
③模型组：
大鼠30只，制作ICH模型（见上述）术后处理同假手术组。
④AS小剂量组：
制模成功后，每日给予AS注射液，6.25ml/kg体重，加生理盐水至2ml，每日1次腹腔注射。
⑤AS大剂量组：
制模成功后，每日给予AS注射液31.25ml/kg体重，分2次腹腔注射，二次注射间隔8h以上，直到处死为止。
除正常组外分别在术后6、12h、1、3、7d断头取脑制作标本，每个时间点观察6只大鼠。
1.2.4组织取材
在相应的时间点用水合氯醛麻醉大鼠，开胸，左心室插管灌注，右心耳剪开引流。
先灌注生理盐水150ml,再以4%多聚甲醛灌注至大鼠发白僵硬，然后快速断头取脑。
沿穿刺针道冠状面自上向下切开至尾状核处，可见血肿灶。
以穿刺点为中心，冠状面取厚度5mm脑组织置于4%多聚甲醛液中固定4h，脱水后石蜡包埋。
以血肿灶为中心制作水平位脑组织切片，切片厚度4μm做苏木素伊红（HE）染色和免疫组织化学染色。
1.3检测方法
1.3.1HE染色方法观察组织病理学变化
切片经梯度酒精水化、HE染色、封片等程序处理后，在光学显微镜下观察血肿周围组织病理变化。
1.3.2血肿周围组织细胞凋亡水平TUNEL染色法检测细胞凋亡。
切片经过氧化氢、复合消化液处理，加末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），37℃孵育1h,用链霉亲和素孵育，DAB显色，HE复染。
对照组以磷酸盐缓冲液（PBS）代替人末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）。
阳性细胞核呈棕黄色颗粒状。
高倍光镜下（400倍）计算凋亡指数（AI）,即每张片选取不重叠10个细胞数最多的高倍视野，计算每个视野中凋亡细胞与总细胞数的百分比和10个视野的平均凋亡细胞百分数，再计算每个时间点（6张切片）平均凋亡细胞百分数。
1.3.3血肿周围组织Bcl2与Bax的表达检测
采用SP方法，加1∶200兔抗大鼠Bcl2、Bax一抗，经过二抗处理，链霉亲和素孵育，DAB显色，HE复染。
Bcl2与Bax阳性细胞胞浆呈棕黄色染色。
计算每个时间点（6张切片）平均阳性细胞数，方法同前述。
1.4统计学处理
采用SPSS13.0统计学处理软件，数据采用x±
s表示。
经过方差齐性检验后，组间两两比较采用单因素方差分析。
2结果
2.1病理形态学结果
HE染色400倍切片中，可观察到血肿周围部分细胞体积缩小，细胞核浓染，细胞核染色质聚集于细胞核一侧呈新月形，并大小不等的核碎片，见图1。
2.2AS对血肿周围组织细胞凋亡的影响
凋亡细胞在TUNEL染色下胞核呈棕褐色。
正常组和假手术组仅有少量凋亡细胞，两组比较差异不明显（P＞0.05）；
模型组、AS小剂量组与AS大剂量组，6h凋亡细胞数即明显高于假手术组，1d达高峰，之后逐渐下降，但至7d仍较假手术组显著增高（P＜0.01）；
AS小剂量组与模型组比较，凋亡细胞数于12h减少（P＜0.05），1、3、7d明显减少（P＜0.01）；
AS大剂量组与模型组比较，凋亡细胞数于12h、1d、3d、7d明显减少（P＜0.01）；
AS大剂量组与AS小剂量组相比，凋亡细胞数于1、3d减少（P＜0.05），7d明显减少（P＜0.01）。
见图1和表1。
表1AS对大鼠ICH后细胞凋亡的影响（略） 2.3AS对血肿周围组织Bcl2表达的影响
Bcl2阳性细胞SP染色时胞浆呈棕褐色，主要表达于大脑皮质与基底节区。
Bcl2表达水平：
假手术组各时间点与正常组对比无显著差异（P＞0.05）；
模型组、AS小剂量组与AS大剂量组6h时即有表达，12h时达高峰，之后逐渐下降，7d仍有相对较高表达。
三组之间差异明显。
模型组各时间点均明显高于假手术组（P＜0.01）；
AS小剂量组12h表达高于模型组（P＜0.05），1、3、7d表达明显高于模型组（P＜0.01）；
AS大剂量组于12h、1d时表达较AS小剂量组增高（P＜0.05），3、7d表达明显高于AS小剂量组（P＜0.01）。
见图1和表2。
表2AS对大鼠ICH后Bcl2的影响（略）
2.4AS对血肿周围组织Bax表达的影响
Bax主要表达于血肿周围区，阳性表达细胞SP染色胞浆呈棕褐色。
假手术组与正常组很少表达，两组无显著差异（P＞0.05）；
模型组、AS小剂量组与AS大剂量组6h时较少表达，12h时开始增加，1d达高峰，3d明显下降，7d仍有表达，三组间有明显差异。
模型组于各时间点均较假手术组明显增加（P＜0.01）；
AS小剂量组表达于12h低于模型组（P＜0.05），1、3、7d明显低于模型组（P＜0.01）；
AS大剂量组于12h、1d、3d低于AS小剂量组（P＜0.05），7d明显低于AS小剂量组（P＜0.01）。
见图1和表3。
表3AS对大鼠ICH后Bax的影响（略）
3讨论
细胞凋亡是由多基因调控的细胞程序性死亡过程，是一种基本生命现象，具有维持机体正常生理过程和多细胞生物正常发育成熟的作用。
细胞凋亡受到机体的严密调控，其过程是瀑布式基因表达过程，许多基因参与这一过程。
其中包括Bcl2基因家族。
该基因家族可分抗凋亡（Bcl2、BclXL等）和促凋亡（bax、bad、bid等）两大亚族。
由Bcl2基因表达的Bcl2蛋白是一种膜合蛋白，包括分子量各为26kD的Bcl2α和21kD的Bcl2β两种相似蛋白，存在于细胞的线粒体、核膜、内质网膜等处，主要功能是抑制细胞凋亡、延长细胞寿命。
作用机制与抑制氧自由基产生、抑制Ca2+释放、阻止半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）激活、抑制Bax蛋白的促凋亡作用以及抑制细胞色素C释放等方面有关。
Bax蛋白是Bcl2的同源蛋白，同样存在于线粒体外膜、内质网膜和核被膜的细胞质面，能够增加线粒体膜通透性，使细胞色素C释放至细胞质并与衔接蛋白即凋亡蛋白激活因子（Apaf1）结合，促进Caspase级联反应，导致细胞死亡。
Bax还通过与Bcl2蛋白结合形成异二聚体，使Bcl2失去抑制细胞凋亡的作用。
正常细胞中，存在Bax与Bcl2微量表达，细胞是否发生凋亡，依赖于Bcl2/Bax的比例〔4〕。
研究〔5〕表明,细胞凋亡是ICH后脑组织损伤的主要原因。
ICH后神经细胞死亡分为坏死和凋亡。
坏死以神经细胞肿胀和溶解为特征,包括群体细胞死亡和继发炎症反应。
凋亡则以细胞核皱缩形成凋亡小体为特征。
血肿压迫、血肿局部血流量下降、自由基大量产生、炎症反应〔6〕、凝血酶〔7〕及血液成分如血红蛋白等因素均可诱发或加重细胞凋亡。
细胞凋亡可以被外界因素如药物、低温等中止，因而抑制细胞凋亡可促进神经功能恢复。
本实验通过应用AS干预大鼠ICH模型，观察其对ICH后凋亡细胞的影响。
AS注射液是一种中药制剂，系AS茎叶精制而成的无菌水溶液。
主要化学成分为异嗪皮定、β谷甾醇、异秦皮定甙、紫丁香树酯醇甙等。
根据祖国医学，AS具有补肾安神、益气固本、活血通络、强身延年之功效。
近年来临床应用AS注射液治疗ICH取得明显效果〔8〕，但其治疗机制仍待深入探讨。
本实验显示,细胞凋亡伴随ICH而大量产生。
但治疗组12h、1、3、7d凋亡细胞数明显低于模型组，且大剂量组疗效明显优于小剂量组。
表明AS可明显对抗ICH神经细胞凋亡。
其机制可能为：
①AS具有清除氧自由基，升高超氧化物歧化酶（SOD）活力，降低过氧化脂质LPO）作用〔9〕；
②扩张脑血管，增加血肿周围局部血流量〔10〕。
可减轻脑水肿，改善微循环，降低血黏度，抑制血小板聚集；
③具有抗炎作用〔11，12〕，抑制炎症因子对血肿周围组织的损伤。
减少炎症因子产生，从而降低了某些炎症因子参与的细胞凋亡过程。
Bax于ICH后6h即有表达，1d达高峰，表明Bax表达高峰期与细胞凋亡一致，显示其与细胞凋亡一致性。
Bcl2在ICH后12h达高峰，表达高峰较Bax提前，此可能与ICH损伤诱发细胞的保护机制激活有关。
ICH时,血肿的占位导致血肿周围组织血流量下降,局部缺血缺氧,产生大量自由基和其他细胞因子〔13〕，诱发细胞凋亡。
AS通过Bcl2表达升高阻止以上因素所诱导的细胞凋亡,发挥抗凋亡作用。
ICH后细胞凋亡和Bcl2、Bax的表达均呈现规律性的变化，从6h至7d，ICH后Bcl2与Bax表达均明显高于正常组与对照组，显示在细胞凋亡调控过程中，各种因子之间的相互拮抗作用。
AS干预后于12h、1、3、7d可明显提高Bcl2表达，于12h、1、3d可降低Bax表达，大剂量组尤为明显。
提示AS可能通过升高Bcl2表达，降低Bax表达而抑制细胞凋亡，从而发挥脑保护作用。
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