酵母葡聚糖硫酸酯的制备及抗凝血活性.docx

1、酵母葡聚糖硫酸酯的制备及抗凝血活性酵母葡聚糖硫酸酯的制备及抗凝血活性摘 要：利用浓硫酸-正丁醇法对酵母葡聚糖进行硫酸酯化修饰，制得多种酵母葡聚糖硫酸酯，其取代度在0.2320.418之间。选择取代度为0.418的产物进行结构和抗凝血活性分析，该产物相对分子量为1.68105，IR和1H NMR图谱显示该产物引入了硫酸基团；抗凝血活性测试结构表明，一定浓度的酵母葡聚糖硫酸酯可显著延长全血凝血时间和血浆凝结时间。关键词：酵母葡聚糖；硫酸酯化；制备；抗凝血Preparation and Anticoagulation Activity of Yeast Glucan SulfateAbstact:

2、Various yeast glucan sulfates were synthesized by sulfate yeast glucan in a reaction system composed ofsulfuric acid and n- butanol. Their sulfate substitute degree are varied in the range of 0.232 to 0.418. The product酵母葡聚糖硫酸酯的制备及抗凝血活性酵母葡聚糖是酵母细胞壁的一种以- （1，3）糖苷键连接为主，含有少量-（1，6）糖苷键连接的分枝的高分子多糖，其独特的三股螺旋紧

3、密三维结构使其具有增强机体免疫活性的功能，在保健食品中已作为功能性配料使用1。酵母葡聚糖的水不溶性限制其应用范围，羧甲基化衍生物可克服酵母葡聚糖的水不溶性的缺点，且因其具有提高皮肤细胞免疫活性作用而逐渐成为高档护肤品中抗衰老抗皱的功能成分2- 3。除了羧甲基化修饰，多糖链中单糖分子上的某些羟基以硫酸根所取代的硫酸酯化修饰也是增加水溶性的常用手段，而且硫酸酯多糖常具多种生物活性，如抗病毒、抗菌，有良好的血液相容性和抗凝血等生物活性4- 7。天然多糖衍生物一般没有细胞毒性，将酵母葡聚糖硫酸酯化 修 饰 合 成 酵 母 葡 聚 糖 硫 酸 酯 （Glucan sulfate,S- glucan），在

4、保留免疫活性基础上，可改善水溶性，其所具有特殊生理活性，将可开发出适合特殊需求人群的功能性保健食品。硫酸酯化的方法常用的有：氯磺酸一吡啶（甲酰胺）法、浓硫酸法等8，前者得率高、硫酸基团取代度大，但采用氯磺酸等剧毒试剂。浓硫酸法虽然产物的取代度稍低，而高取代度并不代表高活性，而且高取代度往往严重破坏酵母葡聚糖原有的三维结构，对保持免疫活性是不利的。本实验采用浓硫酸- 正丁醇法，制备酵母葡聚糖硫酸酯，测定其硫酸基团取代度和分子量，用红外光谱及1H NMR进行结构分析鉴定, 并初步分析其抗凝血活性。1材料与方法1.1材料与仪器酵母葡聚糖和羧甲基酵母葡聚糖3：广东药学院生物化学实验室制备；健康人枸橼酸

5、化血浆：购自广东武警医院；类凝血酶Agacutin：昆明龙津药业有限公司提供；其余试剂均为国产分析纯试剂。ALPHA1- 4型真空冷冻干燥机：德国CHRTST公司；Nexus670型红外光谱仪：美国Thermo Nicolet公司；515- 410型凝胶渗透仪：美国Waters公司；Mercury- Plus300核磁共振波谱仪：美国 VARIAN公司。1.2方法1.2.1酵母葡聚糖硫酸酯的制备参考9方法，分别量取一定量的浓硫酸、正丁醇，置于带干燥管和搅拌装置的三颈瓶中，搅拌，冰浴冷却至- 5 ，缓慢加入200 目的酵母葡聚糖粉末5 g。反应温度对于以浓硫酸为酯化剂的酯化反应很重要，超过0 ，

6、则多糖的酸水解作用明显。试验中保持反应温度- 5 ，反应一定时间后，反应体系用NaOH中和，离心，蒸馏水透析24 h，减压浓缩至20 mL左右，加入体积分数95 %乙醇，静置后离心，收集沉淀物，将沉淀物溶解于水，再透析24 h，透析液经冷冻干燥后得S- glucan。1.2.2 纯度鉴定及相对分子量测定应用美国Waters 515- 410凝胶渗透仪测定硫酸酯化产物的相对分子量。1.2.3硫酸基含量测定10采用BaCl2- 明胶浊度法，S- glucan中硫酸基含量用取代度（degree ofsulfur，DS）来表示。DS是指S- glucan上每个葡萄糖残基中含有的硫酸基团的平均个数。取代

7、度计算公式：DS=（1.62S %）（/32- 1.02S %），式中S %为硫酸基的百分含量。1.2.4红外光谱分析KBr压片，采用Nicolet 670 FT- IR（Thermo Nicolet,USA）红外光谱仪测定，500cm- 14 000 cm- 1范围内扫描。1.2.5核磁共振1HNMR分析以氘代DMSO（DMSO- d6）为溶剂（TMS内标），采用Mercury- Plus 300（Varian, USA）核磁共振。扫描 128 次，选择四甲基硅烷（TMS）作为内标物。1.2.6抗凝血活性的测试1.2.6.1体外全血凝血时间测定11取管径均匀、清洁干燥的小试管若干支，每管加入

8、供试品溶液0.1 mL。大鼠麻醉后，断头取血，迅速沿管壁每管缓慢注入大鼠血0.9 mL，立即混匀并将小试管置于（370.5）恒温水浴中。从血液离体后至完全凝固所需要的时间即为凝血时间，记录各组的凝血时间。1.2.6.2 改进法测定人血浆凝结时间取洁净玻璃小试管，每管预先加入生理盐水20 L和Agacutin酶液200 L（本测试以类凝血酶替代凝血of DS 0.418 was selected for structural analysis and anticoagulation investigation. Its average molecular weight is1.68105, IR

9、 and1H NMR spectrums indicate the introduction of sulfate groups by sulfation. Coagulation assaysshow that glucan sulfate at a certain dosage can significantly prolong in vitro clotting time of rat blood andcoaguation time in plasma.Key words: yeast glucan; sulfation; preparation; anticoagulation基础研

10、究33n（浓硫酸）n（正丁醇）DS表 1 酯化反应中浓硫酸与正丁醇摩尔比对取代度的影响Table 1 The relationship between the propotion of sulfuric acid-butanol and DS0.810.2321.210.256110.2391.610.2811.410.418反应时间/hDS表 2 酯化反应中反应时间对取代度的影响Table 2 The relation ship between reaction time and DS0.50.3031.50.4181.00.3312.50.3532.00.345酶），混匀，37 保温5 m

11、in，然后加入预先37 保温的人枸橼酸化血浆200 L，混匀，37 保温，肉眼观察。从加入血浆起到血浆开始出现凝结状为血浆凝结时间。试验中适当调整酶的浓度，以使对照管的凝结时间为约60 s，测定组均以此酶浓度进行测试。取不同浓度的样品液20 L代替生理盐水进行上述实验，记录血浆凝结时间。2结果与讨论2.1硫酸酯化条件的单一因素实验分析2.1.1浓硫酸与正丁醇比例对取代度的影响葡聚糖的磺化反应是一个非均相固液二相反应，部分硫酸在反应中被消耗，产生一定量的水，同时还存在其他副反应，如葡聚糖的酸水解、碳化以及脱水，通过优化反应条件控制副反应的进行尤其重要8。虽然与均相体系反应相比产物的硫酸基取代度较

12、低，但反应底物酵母葡聚糖和产物葡聚糖硫酸酯均不溶于反应体系，分离产物较为容易，并且正丙醇硫酸反应液可以重复使用，较均相反应体系的氯磺酸、甲酰胺等试剂的环境环境污染小。酯化实验中，浓硫酸和正丁醇的总体积为250 mL，反应时间为1.5 h。调整两者的比例，测定各产物硫酸基团的取代度。结果如表1所示。由表1可知，浓硫酸与正丁醇摩尔比为1.41时的取代度最高。浓硫酸浓度较高，则酯化反应较易进行，但过高比例的浓硫酸，副反应也加快，而且酵母葡聚糖和产物葡聚糖硫酸酯被硫酸水解的程度增加，会使得率下降。2.1.2反应时间对取代度的影响确定浓硫酸和正丁醇的摩尔比为1.41，考察酯化反应时间对酵母葡聚糖酯化的影

13、响。酯化反应不同的时间，产物分别测定硫酸基团的取代度，结果如表2所示。反应时间为1.5 h的样品取代度最高。在所考察的5个不同的反应时间中，随着反应时间延长，DS先呈现上升趋势，在反应时间1.5 h时DS最高为0.418，再延长反应时间，DS开始下降，但下降幅度不大，并维持相对稳定。反应时间过长，相对而言副反应增加，水解也加强，对制备合适取代度的产物并不利。2.2 纯度及相对分子量分析冷冻干燥后所得样品为灰白色粉末，易溶解于水。分子排阻层析色谱测定样品为单一吸收峰，表明样品纯度较好，相对分子量为1.68105。2.3酵母葡聚糖硫酸酯的红外光谱分析选取酵母葡聚糖（Y- glucan） 和取代度为

14、0.303、0.418、0.345的S- glucan共4 个样品进行红外光谱测试。红外光谱见图1。由图1可知，在功能区，波数3 413、2 922、1 748 cm- 1处有明显的吸收，分别对应的是多OH，CH，CO的伸缩振动吸收带。产物在1157、1074、1 041、891 cm- 1处存在显著特征吸收带，连接方式仍然是- 型，说明衍生化没有破坏多糖主链的结构。红外谱图揭示，3种取代度的S- glucan在1 240、810 cm- 1有吸收带，它们分别对应SO拉伸和C- O- S振动，为硫酸酯的特征吸收峰，说明酵母葡聚糖分子中已经成功引入了硫酸基团。2.4核磁共振氢谱分析核磁共振氢谱分

15、析，见图2。由图2可知，比较酵母葡聚糖 （Y- glucan）和S- glucan（DS 0.418样品）的1H NMR谱图，酵母葡聚糖谱图1 酵母葡聚糖及其硫酸酯红外谱图比较Fig.1 Comparison of yeast glucans infrared spectra before andafter sulfationY-glucan注: 谱图从上至下分别为DS 0.303、0.418、0.345的S-glucan、Y-glucan。波数/cm-1透光率/%王庆华，等：酵母葡聚糖硫酸酯的制备及抗凝血活性基础研究ppm（f1）34图2 酵母葡聚糖及其硫酸酯1H NMR图谱Fig.21H

16、NMR spectra of yeast glucans and its sulfated derivativeS-glucan组别生理盐水S-glucanC-glucan表 3 不同质量浓度样品对大鼠全血凝血时间的影响(n=6)Table 3 Effects of different dosages of sample on the clotting timeof rat blood in vitro葡聚糖浓度 （/g/mL）05105050凝结时间/s624595653794*654注：*与生理盐水对照组比较P0.01。组别生理盐水S-glucanC-glucan表 4 不同质量浓度样品对

17、人血浆凝结时间的影响(n=6)Table 4 Effects of different dosages of sample on the coagulationtime in plasma葡聚糖浓度 （/g/mL）00.10.20.50.5凝结时间/s257152641530216*36718*26112注：*与生理盐水对照组比较P0.01。图于4.45.4之间有峰，而S- glucan的谱图没有与之对应的峰，说明与之对应的H被取代。2.5酵母葡聚糖硫酸酯的抗凝血活性分析酵母葡萄糖硫酸酯的抗凝血活性分析，结果见表3、表4。测试取代度为0.418的S- glucan的抗凝血活性，并与C- glu

18、can进行比较。全血凝血时间测定实验中，血液离体后与异物表面接触，使凝血过程启动，参与凝血的因子被激活，最后使纤维蛋白原转化为纤维蛋白，血液凝固，若凝血过程受到抗凝血因子的抑制，使血液凝血时间延长。表3结果显示，随着S- glucan浓度的增加，凝血时间延长，50 g/mL浓度的S- glucan具有明显的抗凝活性，而相同浓度的C- glucan未显示抗凝血活性。凝血酶在凝血过程中作用于血浆可溶的纤维蛋白原，将其转变为不可溶解的纤维蛋白。血浆凝结时间测定试验中，在血浆中添加类凝血酶使凝血时间加快，通过抗凝血物质的加入，延长血浆凝结时间反映样品对凝血过程的作用。表4结果显示，0.2、0.5 mg

19、/mL浓度的S- glucan抗凝血活性明显，而0.5 mg/mL的C- glucan未显示抗凝血活性。2 种抗凝血测试方法的结果说明，本试验所得到的S- glucan具有抗凝血活性，而羧甲基化修饰的酵母葡聚糖并未显示此种活性。3结论本研究表明, 浓硫酸- 正丁醇法是合成酵母葡聚糖硫酸酯的有效方法。在浓硫酸与正丁醇摩尔比为1.41，反应时间1.5 h条件得到的样品硫酸基取代度为0.418，红外光谱和1H NMR图谱显示, 产物已形成硫酸酯，分子量测定为1.68105，水溶性较好。经凝血活性测试显示该酵母葡聚糖硫酸酯具有抗凝血活性，结合酵母葡聚糖原有的免疫活性，有望开发成新一代功能性保健食品成分

20、。参考文献：1 Sandula J, Kogam G, Kacurakora M, et al. Microbial(1-3)-glucan,theirpreparation,physico-chemicalcharacterizationandimmunomodatory activityJ. Carbohydrate polymers, 1999,38 (3):247-2532 Zlli F, Suter F, Biltz H, et al. Improving skin function with CM -glucan, a biological response modifier fr

21、om yeast J. Internationaljournal of cosmetic science,1998,20(2): 79-863王庆华,舒锦华,刘山,等. 羧甲基酵母葡聚糖在护肤品中的应用研究J.广东化工,2010,37(6):7-94 黄小燕,孔祥峰,王德云,等.多糖硫酸化修饰和多糖硫酸酯的研究进展J.天然产物研究与开发,2007,19(2):328-3325 Alban S, Schauerte A, Franz G. Anticoagulant sulfated polysaccha-rides: Part I. Synthesis and structure -activ

22、ity relationships of newpullulan sulfates J. Carbohydr polymers, 2002, 47(3): 267-2766 王兆梅,李琳,郭祀远.生物活性多糖在化妆品中的应用J.日用化学工业,2004,34(4):245-2487 张难,吴远根,周剑丽,等.多糖的分子修饰及其在功能性食品中的应用展望J.食品研究与开发,2007,28(8):159-1638 田庚元,李寿桐,宋麦丽,等.牛膝多糖硫酸酯的合成及其抗病毒活性J.药学学报,1995,30(2):107-1119沈彧,姚善泾,叶子坚.纤维素硫酸钠的制备方法及工艺条件的研究J.化学反应工程与工艺, 1999,15(3):307-31310 张惟杰.糖复合物生化研究技术M.杭州:浙江大学出版社,1994:39811徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学M.3版.北京:人民卫生出版社,2002:1270-1272收稿日期：2010-12-17基础研究 王庆华，等：酵母葡聚糖硫酸酯的制备及抗凝血活性ppm（f1）35