酵母葡聚糖硫酸酯的制备及抗凝血活性.docx
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酵母葡聚糖硫酸酯的制备及抗凝血活性
酵母葡聚糖硫酸酯的制备及抗凝血活性
摘要：
利用浓硫酸-正丁醇法对酵母葡聚糖进行硫酸酯化修饰，制得多种酵母葡聚糖硫酸酯，其取代度在0.232~0.418之间。
选择取代度为0.418的产物进行结构和抗凝血活性分析，该产物相对分子量为1.68×105，IR和1HNMR图谱显示该产物引入了硫酸基团；抗凝血活性测试结构表明，一定浓度的酵母葡聚糖硫酸酯可显著延长全血凝血时间和血浆凝结时间。
关键词：
酵母葡聚糖；硫酸酯化；制备；抗凝血
PreparationandAnticoagulationActivityofYeastGlucanSulfate
Abstact:
Variousyeastglucansulfatesweresynthesizedbysulfateyeastglucaninareactionsystemcomposedof
sulfuricacidandn-butanol.Theirsulfatesubstitutedegreearevariedintherangeof0.232to0.418.Theproduct
酵母葡聚糖硫酸酯的制备及抗凝血活性
酵母葡聚糖是酵母细胞壁的一种以β-（1，3）糖
苷键连接为主，含有少量
β-
（1，6）糖苷键连接的分枝
的高分子多糖，其独特的三股螺旋紧密三维结构使其
具有增强机体免疫活性的功能，在保健食品中已作为
功能性配料使用
[1]
。
酵母葡聚糖的水不溶性限制其应用
范围，羧甲基化衍生物可克服酵母葡聚糖的水不溶性
的缺点，且因其具有提高皮肤细胞免疫活性作用而逐
渐成为高档护肤品中抗衰老抗皱的功能成分
[2-3]
。
除了
羧甲基化修饰，多糖链中单糖分子上的某些羟基以硫
酸根所取代的硫酸酯化修饰也是增加水溶性的常用手
段，而且硫酸酯多糖常具多种生物活性，如抗病毒、抗
菌，有良好的血液相容性和抗凝血等生物活性
[4-7]
。
天然
多糖衍生物一般没有细胞毒性，将酵母葡聚糖硫酸酯
化修饰合成酵母葡聚糖硫酸酯（Glucansulfate,
S-glucan
），在保留免疫活性基础上，可改善水溶性，其
所具有特殊生理活性，将可开发出适合特殊需求人群
的功能性保健食品
。
硫酸酯化的方法常用的有：
氯磺酸一吡啶（甲酰
胺）法
、浓硫酸法等
[8]
，前者得率高
、硫酸基团取代度大，
但采用氯磺酸等剧毒试剂。
浓硫酸法虽然产物的取代
度稍低，而高取代度并不代表高活性，而且高取代度往
往严重破坏酵母葡聚糖原有的三维结构，对保持免疫
活性是不利的。
本实验采用浓硫酸-正丁醇法，制备酵
母葡聚糖硫酸酯，测定其硫酸基团取代度和分子量，用
红外光谱及
1
HNMR进行结构分析鉴定,并初步分析其
抗凝血活性
。
1
材料与方法
1.1
材料与仪器
酵母葡聚糖和羧甲基酵母葡聚糖
[3]
：
广东药学院
生物化学实验室制备；健康人枸橼酸化血浆：
购自广东
武警医院；类凝血酶Agacutin：
昆明龙津药业有限公司
提供；其余试剂均为国产分析纯试剂。
ALPHA1-4
型真空冷冻干燥机：
德国CHRTST公
司；
Nexus670型红外光谱仪：
美国ThermoNicolet公司；
515-410型凝胶渗透仪：
美国Waters公司；Mercury-Plus
300核磁共振波谱仪：
美国VARIAN公司。
1.2
方法
1.2.1
酵母葡聚糖硫酸酯的制备
参考
[9]
方法，分别量取一定量的浓硫酸、正丁醇，
置于带干燥管和搅拌装置的三颈瓶中，搅拌，冰浴冷却
至-5℃，缓慢加入200目的酵母葡聚糖粉末5g。
反应
温度对于以浓硫酸为酯化剂的酯化反应很重要，超
过
0℃
，则多糖的酸水解作用明显。
试验中保持反应温
度-5℃，反应一定时间后，反应体系用NaOH中和，离
心，蒸馏水透析24h，减压浓缩至20mL左右，加入体积
分数
95%乙醇，静置后离心，收集沉淀物，将沉淀物溶
解于水，再透析24h，透析液经冷冻干燥后得S-glucan。
1.2.2纯度鉴定及相对分子量测定
应用美国Waters515-410凝胶渗透仪测定硫酸酯
化产物的相对分子量。
1.2.3
硫酸基含量测定
[10]
采用
BaCl
2
-明胶浊度法，S-glucan中硫酸基含量用
取代度（degreeofsulfur，DS）来表示。
DS是指S-glucan上
每个葡萄糖残基中含有的硫酸基团的平均个数。
取代
度计算公式：
DS=（1.62×S%）（/32-1.02×S%），式
中S%为硫酸基的百分含量。
1.2.4
红外光谱分析
KBr
压片，采用Nicolet670FT-IR（ThermoNicolet,
USA
）红外光谱仪测定，500cm
-1
~4000cm
-1
范围内扫描。
1.2.5
核磁共振
1
HNMR
分析
以氘代DMSO（DMSO-d6）为溶剂（TMS内标），采用
Mercury-Plus300（Varian,USA）核磁共振。
扫描128次，
选择四甲基硅烷（
TMS）作为内标物。
1.2.6
抗凝血活性的测试
1.2.6.1
体外全血凝血时间测定
[11]
取管径均匀、清洁干燥的小试管若干支，每管加入
供试品溶液
0.1mL。
大鼠麻醉后，断头取血，迅速沿管
壁每管缓慢注入大鼠血0.9mL，立即混匀并将小试管
置于（37±0.5）℃恒温水浴中。
从血液离体后至完全凝
固所需要的时间即为凝血时间，记录各组的凝血时间。
1.2.6.2改进法测定人血浆凝结时间
取洁净玻璃小试管，每管预先加入生理盐水
20μL
和Agacutin酶液200μL（本测试以类凝血酶替代凝血
ofDS0.418wasselectedforstructuralanalysisandanticoagulationinvestigation.Itsaveragemolecularweightis
1.68×10
5
IRand
1
HNMRspectrumsindicatetheintroductionofsulfategroupsbysulfation.Coagulationassays
showthatglucansulfateatacertaindosagecansignificantlyprolonginvitroclottingtimeofratbloodand
coaguationtimeinplasma.
Keywords:
yeastglucan;sulfation;preparation;anticoagulation
基础研究
33n（浓硫酸）∶n（正丁醇）
DS
表1酯化反应中浓硫酸与正丁醇摩尔比对取代度的影响
Table1Therelationshipbetweenthepropotionofsulfuricacid-
butanolandDS
0.8∶1
0.232
1.2∶1
0.256
1∶1
0.239
1.6∶1
0.281
1.4∶1
0.418
反应时间/h
DS
表2酯化反应中反应时间对取代度的影响
Table2TherelationshipbetweenreactiontimeandDS
0.5
0.303
1.5
0.418
1.0
0.331
2.5
0.353
2.0
0.345
酶），混匀，
37℃保温5min，然后加入预先37℃保温的
人枸橼酸化血浆200μL，混匀，37℃保温，肉眼观察。
从
加入血浆起到血浆开始出现凝结状为血浆凝结时间
。
试验中适当调整酶的浓度，以使对照管的凝结时间为
约
60s，测定组均以此酶浓度进行测试。
取不同浓度的
样品液20μL代替生理盐水进行上述实验，记录血浆凝
结时间。
2
结果与讨论
2.1
硫酸酯化条件的单一因素实验分析
2.1.1
浓硫酸与正丁醇比例对取代度的影响
葡聚糖的磺化反应是一个非均相固液二相反应，
部分硫酸在反应中被消耗，产生一定量的水，同时还存
在其他副反应，如葡聚糖的酸水解、碳化以及脱水，通
过优化反应条件控制副反应的进行尤其重要
[8]
。
虽然与
均相体系反应相比产物的硫酸基取代度较低，但反应
底物酵母葡聚糖和产物葡聚糖硫酸酯均不溶于反应体
系，分离产物较为容易，并且正丙醇硫酸反应液可以重
复使用，较均相反应体系的氯磺酸、甲酰胺等试剂的环
境环境污染小
。
酯化实验中，浓硫酸和正丁醇的总体积为250mL，
反应时间为1.5h。
调整两者的比例，测定各产物硫酸基
团的取代度
。
结果如表1所示。
由表1可知，浓硫酸与正丁醇摩尔比为1.4∶1时的
取代度最高。
浓硫酸浓度较高，则酯化反应较易进行，
但过高比例的浓硫酸，副反应也加快，而且酵母葡聚糖
和产物葡聚糖硫酸酯被硫酸水解的程度增加，会使得
率下降。
2.1.2
反应时间对取代度的影响
确定浓硫酸和正丁醇的摩尔比为1.4∶1，考察酯化
反应时间对酵母葡聚糖酯化的影响。
酯化反应不同的
时间，产物分别测定硫酸基团的取代度，结果如表2所示。
反应时间为1.5h的样品取代度最高。
在所考察的
5
个不同的反应时间中，随着反应时间延长，DS先呈现
上升趋势，在反应时间1.5h时DS最高为0.418，再延长
反应时间，
DS开始下降，但下降幅度不大，并维持相对
稳定。
反应时间过长，相对而言副反应增加，水解也加
强，对制备合适取代度的产物并不利
。
2.2纯度及相对分子量分析
冷冻干燥后所得样品为灰白色粉末，易溶解于
水。
分子排阻层析色谱测定样品为单一吸收峰，表明样
品纯度较好，相对分子量为1.68×10
5
。
2.3
酵母葡聚糖硫酸酯的红外光谱分析
选取酵母葡聚糖（
Y-glucan
）和取代度为0.303、
0.418、0.345
的S-glucan共4个样品进行红外光谱测试。
红外光谱见图1。
由图
1可知，在功能区，波数3413、2922、1748cm
-1
处有明显的吸收，分别对应的是多—OH，C—H，CO的
伸缩振动吸收带。
产物在1157、1074、1041、891cm
-1
处
存在显著特征吸收带，连接方式仍然是β-型，说明衍
生化没有破坏多糖主链的结构。
红外谱图揭示，3种取
代度的S-glucan在1240、810cm
-1
有吸收带，它们分别
对应
SO
拉伸和C-O-S振动，为硫酸酯的特征吸收峰，说
明酵母葡聚糖分子中已经成功引入了硫酸基团。
2.4
核磁共振氢谱分析
核磁共振氢谱分析，见图2。
由图2可知，比较酵母葡聚糖（Y-glucan）和
S-glucan（DS0.418样品）的
1
HNMR谱图，酵母葡聚糖谱
图1酵母葡聚糖及其硫酸酯红外谱图比较
Fig.1Comparisonofyeastglucansinfraredspectrabeforeand
aftersulfation
Y-glucan
注:
谱图从上至下分别为DS0.303、0.418、0.345的S-glucan、Y-glucan。
波数/cm
-1
透
光
率
/
%
王庆华，等：
酵母葡聚糖硫酸酯的制备及抗凝血活性基础研究
ppm（f1）
34图2酵母葡聚糖及其硫酸酯
1
HNMR
图谱
Fig.2
1
HNMRspectraofyeastglucansanditssulfatedderivative
S-glucan
组别
生理盐水
S-glucan
C-glucan
表3不同质量浓度样品对大鼠全血凝血时间的影响（n=6）
Table3Effectsofdifferentdosagesofsampleontheclottingtime
ofratbloodinvitro
葡聚糖浓度（/μg/mL）
0
5
10
50
50
凝结时间/s
62±4
59±5
65±3
79±4
*
65±4
注：
*与生理盐水对照组比较P<0.01。
组别
生理盐水
S-glucan
C-glucan
表4不同质量浓度样品对人血浆凝结时间的影响（n=6）
Table4Effectsofdifferentdosagesofsampleonthecoagulation
timeinplasma
葡聚糖浓度（/μg/mL）
0
0.1
0.2
0.5
0.5
凝结时间/s
257±15
264±15
302±16
*
367±18
*
261±12
注：
*与生理盐水对照组比较P<0.01。
图于4.4~5.4之间有峰，而S-glucan的谱图没有与之对
应的峰，说明与之对应的H被取代。
2.5
酵母葡聚糖硫酸酯的抗凝血活性分析
酵母葡萄糖硫酸酯的抗凝血活性分析，结果见
表
3、
表4。
测试取代度为0.418的S-glucan的抗凝血活性，并
与C-glucan进行比较。
全血凝血时间测定实验中，血液
离体后与异物表面接触，使凝血过程启动，参与凝血的
因子被激活，最后使纤维蛋白原转化为纤维蛋白，血液
凝固，若凝血过程受到抗凝血因子的抑制，使血液凝血
时间延长
。
表3结果显示，随着S-glucan浓度的增加，凝
血时间延长，50μg/mL浓度的S-glucan具有明显的抗凝
活性，而相同浓度的C-glucan未显示抗凝血活性。
凝血酶在凝血过程中作用于血浆可溶的纤维蛋
白原，将其转变为不可溶解的纤维蛋白。
血浆凝结时间
测定试验中，在血浆中添加类凝血酶使凝血时间加快，
通过抗凝血物质的加入，延长血浆凝结时间反映样品
对凝血过程的作用
。
表4结果显示，0.2、0.5mg/mL浓度
的
S-glucan抗凝血活性明显，而0.5mg/mL的C-glucan未
显示抗凝血活性
。
2种抗凝血测试方法的结果说明，本试验所得到
的S-glucan具有抗凝血活性，而羧甲基化修饰的酵母
葡聚糖并未显示此种活性。
3
结论
本研究表明,浓硫酸-正丁醇法是合成酵母葡聚
糖硫酸酯的有效方法。
在浓硫酸与正丁醇摩尔比为1.4∶1，
反应时间1.5h条件得到的样品硫酸基取代度为0.418，
红外光谱和
1
HNMR
图谱显示,产物已形成硫酸酯，分
子量测定为
1.68×10
5
，水溶性较好。
经凝血活性测试显
示该酵母葡聚糖硫酸酯具有抗凝血活性，结合酵母葡
聚糖原有的免疫活性，有望开发成新一代功能性保健
食品成分。
参考文献：
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徐叔云
卞如濂
陈修
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药理实验方法学
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北京
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人民卫生出
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1270-1272
收稿日期：
2010-12-17
基础研究王庆华，等：
酵母葡聚糖硫酸酯的制备及抗凝血活性
ppm
（f1）
35
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