7A版发酵工程实验报告之果汁澄清Word格式.docx

1、粘度降低法：利用粘度计测量在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。还原糖法（DNS法）：测定在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，水解果胶产生的还原糖的量。DNS法：根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，后者是一种还原糖，与3，5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。4、微生物发酵生产产品受以下条件制约：培养基成分：C源、N源、无机盐、水和生长因子培养条件：温度、

2、pH、溶解氧等附加条件：诱导物、表面活性剂等5、酶催化反应的进行受多种因素的影响底物浓度酶浓度温度pH激活剂抑制剂三、 实验材料（一）试剂1、酶活测定用试剂和DNS2、新鲜果汁（二）仪器烧杯、三角瓶、试管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、试剂瓶、研钵等；天平、灭菌锅、超净工作台、培养箱、电炉、恒温水浴锅、记时器（精确到秒）、分光光度计等。（三）培养基1、菌种筛选使用2、黑曲霉Asp-2固体发酵用1、菌种筛选使用培养基基本培养基:果胶1%，磷酸氢二钠0.5%，蛋白胨1%，pH4.5，琼脂2.0%。分离培养基果胶0.5%，磷酸氢二钠0.5%，琼脂2.0%，pH4.5（3）发酵培养基果胶1%，磷酸氢二

3、钠0.5%，蛋白胨1%，pH4.5。2、黑曲霉Asp-2固体发酵培养基菌种斜面培养基（查氏培养基）NaNO30.2%K2HPO40.1%KCl0.05%MgSO40.05%FeSO40.001%蔗糖3%琼脂2.5%自然pH种子培养基麸皮3.0%，橘子粉2.0%，硫酸铵0.5%,葡萄糖1%，KH2PO40.1%pH4.5固体发酵培养基：5瓶/组麸皮10g，橘子粉2.5g，（NH4）SO40.1g（0.8%干料计）葡萄糖0.125g（1%干料计），水15ml要求：按组统一配制后分装三角瓶先将（NH4）SO4、葡萄糖用水溶解，再加其它。四、 实验方法、步骤及注意事项：（1）固体发酵果胶酶1、菌种准备

4、菌种活化：试管保存菌种斜面活化30培养约60h液体培养：将菌种接种入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶内，30，200rpm，培养约40h，备用。2、氮源的选择和选择的氮源添加量对产酶的影响（第一组）选择硫酸铵、蛋白胨、牛肉膏按照1%浓度替换发酵培养基中的蛋白胨，接种5%液体种子，培养48小时，测定酶活。在发酵培养基中分别添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%（按干料计）浓度的已选择的氮源，保持培养基的其它成分不变，在相同接种量（约5%，即1.5ml）相同培养条件下（30，60h）发酵，测定酶活。3、碳源的选择和选择的碳源添加量对产酶的影响（第二组）选择果胶、葡萄糖、橘子粉

5、按照1%浓度替换发酵培养基中的蛋白胨，接种5%液体种子，培养48小时，测定酶活。在液体发酵培养基中分别添加0、0.5%、1.0、2%、3.%的选择的碳源，保持培养基的其它成分不变，在相同条件下接种液体种子（约5%，即1.5ml），相同培养条件下，30，发酵60h，测定酶活。4、培养基含水量对产酶的影响（第三组）在发酵培养基中加入蒸馏水，使培养基中的含水量分别约为50%、55%、60%、65%和70%；保持培养基的其它成分不变，在相同接种量（5%，即1.5ml）相同培养条件下（30，4860h）发酵，测定酶活。5、接种量对产酶的影响（第三组）分别以4%、5%、6%、7%和8%的接种量接种果胶酶产

6、生菌于发酵培养基中，在相同的培养条件下（30，4860h）发酵，测定酶活。注意：由于接种的是液体菌种，所以在配制培养基时要将接种时多出的水分去掉。6、发酵时间对产酶的影响（第四组）在相同的培养基、相同的接种量（5%，即1.5ml）和相同培养条件下（30）分别发酵36、48、60、72和84h，测定酶活。精确计算时间，准时取出发酵产物。7、发酵温度对产酶的影响（第五组）保持培养基成分和接种量（5%，即1.5ml）不变，分别在室温、30、37和45的温度条件下发酵4860h，测定酶活。先把培养箱调到相应的温度！8、果胶酶酶活的测定（1）待测酶液的制备烘干：把发酵产物倒于平皿中，45烘干过夜；制备酶

7、粉：将烘干的发酵产物用研钵研磨成粉状（尽量磨细），装于塑料袋中备用；制备酶液：称取0.1g酶粉，充分溶解于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（稀释100倍），纱布（4层）过滤去除杂质；如果测定所得OD值不在有效值（0.2-0.6）范围内，则相应地降低或增大稀释倍数后再进行测定。（2）果胶酶酶活测定方法OD=（A+B）/2酶活定义：在pH3.0、37条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放1mol半乳糖醛酸所需要的酶量为一个酶活单位U/g。酶活计算公式酶活（U/g）=A5KN1000/（TWM）A:样品的OD值（平均值）K:标准曲线的斜率N:稀释倍数5：0.2毫升反应液转换为1毫升体积T:反应时间（mi

8、n）1000：转换因子1mmol=1000molW:半乳糖醛酸的分子量（212.16g/mol）M:称取酶粉克数（g）绘制标准曲线的方法先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量。半乳糖醛酸标准曲线的制作精确称取0.100g半乳糖醛酸，用缓冲溶液定容至100ml，制得浓度为1mg/ml的半乳糖醛酸的标准溶液。标准曲线如下图表所示（3）注意事项试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布

9、，以防止保温或沸水加热时脱落；移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头！精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；实验结果的记录与分析9、仪器的使用恒温水浴锅分光光度计烘箱移液枪UV20GG型分光光度计的使用注意提前半小时接通电源，打开机器开关使仪器通电，自检；将对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用镜头纸擦干外壁，放入样品室；调节测定所用波长；读数完毕，打开仪器盖板，关闭开关，将比色杯冲洗干净、浸泡于30酒精中。注意事项1、接种接种方式是液体固体，用灭菌

10、的移液管或10ml量筒接种或大枪头；接种后振荡接种瓶，使菌种充分与固体培养基混合。2、水浴锅的使用：水量（蒸馏水）要超过试管中的液面3、分光光度计使用时注意：测定OD在540nm、以对照为参比、测定吸光值4、及时清洗用过的枪头实验准备内容（1）黑曲霉Asp-2固体发酵用的培养基5瓶/组注意配方等的不同，做好标记！（2）灭菌培养基其它：10ml量筒（纱布和报纸包口）、移液管（塞棉花）等时间：灭菌45min1、酶粉的选择：同一大组采用同一酶粉进行应用性质的实验！2、水浴锅的使用水浴锅的水量（蒸馏水）要超过试管中的液面各大组“处理时间”这项实验共同在1个水浴锅中进行3、分光光度计使用时注意OD660

11、nm以蒸馏水为参比测定透光率五、 实验报告（一）、实验结果本次实验在菌种分离时，已经分离到能产生果胶酶的菌株，但是在后期的培养过程中，发生一点点的错误，导致培养出来的菌种没有酶活，也就是实验失败。（二）结果分析从培养的初期来看，实验能得到菌种，说明实验有成功的契机，但是在经过发酵培养之后，菌株没有酶活，也就是在发酵培养时出现意外，本次试验提醒我们做实验和做事要仔细认真，步步为营。（二）应用发酵制备的酶液进行果汁澄清的应用实验第十四周六、 实验目的：了解影响果胶酶对果汁澄清效果的各种因素七、 实验原理：1、果胶酶的应用：2、脱胶作用时间法：3、次亚碘酸法：4、还原糖法（DNS法）：八、 实验材料

12、1、仪器设备：2、材料：新鲜果汁、NAOH溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲、DNS试剂等等。九、 实验方法、步骤及注意事项：（一）待测酶液的制备1、制备酶液：称取1g酶粉，充分溶解于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（稀释10倍），高速冷冻离心（10000转、5min）去除杂质；2、根据发酵条件优化实验中测定所得OD值大小，选择酶活最高的酶粉制备酶液。（二）果汁的制备1、水果清洗破碎榨汁2、稀释：用pH3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释至10倍（三）果胶酶的应用性实验果汁澄清实验1、果汁澄清的基本方法步骤样品A管样品B管空白管步骤1吸取稀释果汁10毫升步骤245保温5min步骤3稀释酶液1mL不加步骤4

13、45精确保温30min步骤5离心（5000转，5分钟）步骤6以蒸馏水为参比，660nm测定透光率T（透光率）=（A+B）/2TTT0空白为T02、果胶酶添加量对澄清效果的影响（1，2组）（1）在反应体系中分别加入0.2、0.5、1.0、1.5和2.0ml的果胶酶液（2）在相同的反应条件（pH3.0，45）下处理30min，以蒸馏水为参比分别测定透光率。3、果汁pH对澄清效果的影响（3，4组）（1）用0.25mol/LH2SO4和3mol/LNaOH分别调节果汁的pH至1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0；（2）在反应体系中加入1.0ml的果胶酶液，相同的反应条件（45

14、）下处理30min，以蒸馏水为参比分别测定透光率。4、果汁温度对澄清效果的影响（5，6组）（1）保持反应体系的其它条件（1.0ml的果胶酶液、pH3.0，30min）不变，分别在室温（温度计测定）、37、45、50、55条件下进行反应30Min;（2）以蒸馏水为参比分别测定透光率。（四）注意事项1、水浴锅的使用（1）水浴锅的水量（蒸馏水）要超过试管中的液面（2）各大组“处理时间”这项实验共同在1个水浴锅中进行2、分光光度计使用时注意（1）OD660nm（2）以蒸馏水为参比（3）测定透光率一十、 实验结果及分析1、对不同的实验组添加不同的果胶酶的量后得到的结果如下:（表一）果胶酶添加量对果汁澄清

15、的影响酶液量（ml）OD660平均值（T）空白（TO）TTT0A管B管0.245.90%74.00%59.95%11.60%48.35%0.539.10%42.70%40.90%12.10%28.80%1.054.30%37.40%45.85%11.40%34.45%1.521.80%9.30%15.55%11.90%3.65%2.047.30%48.90%48.10%12.00%36.10%根据上表格做出的折线图（图一）如下：【透光率之差（TTT0）】分析：根据表格数据及折线图中的信息可以看出T随着酶量的增加逐渐下降，到酶量为1.5ML时突然上升。但是根据理论分析随着酶量的增加T的值应该是逐

16、渐上升，直到某一浓度之后不再增加。出现上图的结果说明实验没有成功，可能的原因有：（1）可能是测OD值时把管号弄混了；（2）可能是加酶时出现漏加现象；（3）从表一中A、B管数据的分布来看，该实验数据的准确性太低，波动大，可信度低。由于种种原因，本次实验未能找出最适加酶量。2、不同PH的果汁对果汁澄清效果有影响的实验结果如下（表二）果汁PH对澄清效果的影响PH管号空白管（TO）A19.60%19.50%20.60%1.10%B19.10%23.50%2.90%35.00%2.561.80%64.00%43.40%66.10%3.074.60%65.50%44.90%66.30%3.580.40%8

17、0.50%59.90%80.80%4.091.90%93.50%72.90%95.00%4.564.40%63.00%42.40%5.036.40%28.00%7.40%20.30%根据表二做出折线图（图二）如下：从表二中的数据来看，A、B两管的数值差距不大，可信度较高，从图二可以看出随着PH的升高T不断的升高，当达到一定的高度之后，T又逐渐下降，在PH=4时T的值达到最高为72.90%。也就是说当果汁的PH=4时果汁澄清的效果最好，即最适的果汁澄清PH为4。建议在今后的实验中用PH=4的果汁进行实验，效果会更好。3、不同反应温度对果汁澄清效果的影响（表三）不同反应温度对果汁澄清效果的影响温度

18、（）T=T-TO室温（27）77.40%76%76.70%12.20%64.50%3796.50%96.60%96.55%84.35%4580.65%79.60%80.13%67.93%5054.70%48.20%51.45%39.25%5544.60%44.50%44.55%32.35%根据表三作得折线图（图三）如下：从表三的数据可以看到A、B两管的实验数据差距不大，可以采用，从折线图中可以看到，T的值随着温度的升高而升高，当到达一定的温度时T的值达到最大，之后T的值又逐渐下降，曲线呈现抛物线型，有一个最高点（37,84.35%），也就说明在温度为37时果汁的澄清效果最好。通过本次实验，我们测量到了果胶酶的最适温度为37，建议今后在用道果胶酶时在37下使用。六、实验总结通过本次实验，我们测量了果胶酶的最适果汁PH、最适反应温度以及最佳的加酶量，得到了该果胶酶的最适果汁PH为PH=4.0，改果胶酶的最适温度为37摄氏度，但是由于种种的原因，我们没有把最佳加酶量测量出来。在本次实验中，小组的各成员积极参与，协调合作，出色的把我们小组负责的工作完成了。通过本次实验我们知道了合作的重要性，对于在本次实验中出现的错误，我们会在今后的学习工作中改进的。七、教师评语及评分：签名：年月日